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.2015年6月24日；11（6）：e1005001。
doi:10.1371/journal.ppat.1005001。 eCollection 2015年6月。

携带KSHV G蛋白偶联受体的重组鼠γ疱疹病毒68诱导小鼠血管病变

张俊杰 1, 朱丽娜 1, 陆小璐 1, 艾米丽·费尔德曼 2, 丽莎·R·凯斯 2, 王毅（Yi Wang） 1, 惠凡 三, 郝峰 三, 赞县夏 4, 孙继雅 5, 姜太娇 6, 高寿江 1, 斯科特·蒂贝茨 2, 冯平慧 1
附属公司

携带KSHV G蛋白偶联受体的重组鼠γ疱疹病毒68诱导小鼠血管病变

张俊杰等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

人类γ疱疹病毒，包括卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV），能够诱发肿瘤，尤其是在免疫受损的个体中。由于严格的寄主嗜性，啮齿动物对人类γ疱疹病毒的感染具有抵抗力，这为体内研究有助于肿瘤发生的病毒基因创造了重大障碍。密切相关的小鼠γ疱疹病毒68（γHV68）可有效感染实验室小鼠株，并在不引起明显疾病的情况下建立稳定的持续感染。在这里，我们报告了携带KSHV G蛋白偶联受体（kGPCR）的重组γHV68代替其小鼠对应物在感染小鼠中诱导血管生成肿瘤。尽管病毒GPCR在所有γ疱疹病毒中都是保守的，但kGPCR能有效激活下游信号传导并诱导裸鼠肿瘤形成，而γHV68 GPCR未能做到这一点。携带kGPCR的重组γHV68在体外表现出比野生型γHV68更强的溶解复制能力，尽管这两种病毒在体内都经历了类似的急性和潜伏感染。携带kGPCR而非野生型γHV68的免疫抑制小鼠感染γHV68后，在小鼠体内诱发肿瘤，表现出与人类卡波西肉瘤相同的血管生成和炎症特征。免疫组织化学染色发现大量潜伏感染细胞和少量支持肿瘤组织中溶解复制的细胞。因此，携带kGPCR的重组γHV68感染小鼠为人类γ疱疹病毒基因在自然感染过程中诱导肿瘤形成提供了一个有用的小动物模型。

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数字

图1
图1。KSHV GPCR（kGPCR）激活下游信号事件，但不激活小鼠γ疱疹病毒68 GPCR（mGPCR）。
用NFAT（a和E）、NF-κB（B和F）和AP-1（C）的报告质粒混合物转染293T细胞，并增加含有kGPCR或mGPCR的质粒数量。报告者在转染全细胞裂解物后30小时进行荧光素酶分析，以确定NFAT、NF-κB和AP-1的激活。（D） 通过增加含有kGPCR或mGPCR的质粒的数量转染293T细胞。用抗HA和抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析全细胞裂解产物。（E和F）NIH 3T3细胞转染NF-κB（E）和NFAT（F）报告鸡尾酒，如（A）所示，但脂质体除外。NF-κB和NFAT的激活通过荧光素酶报告分析测定。
图2
图2。kGPCR和mGPCR的差异信号和致瘤能力。
（A） 将稳定表达kGPCR或mGPCR的小鼠SVEC内皮细胞固定并用HA表位抗体（kGPCR和mGPCR）、TGN46（高尔基标记物）或PDI（ER标记物）染色，细胞核用DAPI染色。使用尼康收集代表性图像，并使用ImageJ进行处理。比例尺表示10μm。（B） 将表达kGPCR或mGPCR的对照SVEC或SVEC稳定细胞饥饿过夜，并用指示的抗体分析全细胞裂解物。pAKT和tAKT分别表示磷酸化AKT和总AKT。（C） 和（D）对照表达kGPCR或mGPCR（5×10）的SVEC或SVEC稳定细胞5)，连同1×106将旁观者常规SVEC细胞注射到裸鼠侧面。注射后四周拍摄肿瘤照片（C），并测定肿瘤重量（D）。
图3
图3。携带kGPCR的重组γHV68的产生和表征。
（A） GPCR基因座与插入基因的关系图布拉重组γHV68.kGPCR的基因（编码β-内酰胺酶），其中mGPCR被携带上游HA表位的kGPCR取代。（B） 和（C）NIH 3T3细胞感染重组γHV68.wt、γHV68.jGPCR或γHV68回复物（γHV68.Rev）（MOI=0.05），并通过三次冷冻/解冻制备全细胞裂解液。使用NIH 3T3单层（B）通过菌斑试验测定γHV68的感染单位，并拍摄菌斑照片（C）。（D） 和（E）NIH 3T3感染重组γHV68，如图所示。在感染后的指定时间点采集细胞。通过逆转录和实时PCR分析提取的总RNA，并使用针对指示基因（D）的特异性引物。制备全细胞裂解物，并用RTA、胸苷激酶（TK或ORF21）和β-肌动蛋白（E）抗体进行免疫印迹分析。对于（B）和（D），参照对照γHV68野生型组计算p值*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001.
图4
图4。小鼠γHV68的急性和潜在感染。
性别和年龄匹配的Balb/c小鼠感染野生型γHV68（mG）或γHV68.kGPCR（mK）（1×10）5pfu）通过腹腔注射。在感染后第3、5和7天收集脾脏（dpi），并通过菌斑试验（A）测定病毒滴度。或者，在16（B）和45 dpi（D）时收集脾脏。通过限制稀释PCR分析确定病毒的上位体基因组。（C） 脾细胞，无论是完整的还是受到机械力破坏的，与小鼠胚胎成纤维细胞共同培养21天，以形成斑块。
图5
图5。γHV68.kGPCR感染诱导免疫抑制小鼠血管生成性损伤。
Balb/c小鼠，6至8周龄雌性，感染（1×10）5pfu）通过腹腔注射。（A） 对15只小鼠中的5只小鼠进行总结，这些小鼠表现出患病状态。一只小鼠同时患有皮下肿瘤和肺纤维化（如D所示）。拍摄小鼠肝脏血管生成结节（B）和后腿皮下肿瘤（C）。（D） 用H&E染色分析γHV68.kGPCR和野生型γHV68感染小鼠的肺部病变。
图6
图6。γHV68.kGPCR感染小鼠血管生成性肿瘤的病理分析。
通过苏木精伊红（H&E）染色（A）和免疫组织化学染色，用HA表位抗体（kGPCR，B）、内皮标记物CD31（c）、增殖标记物Ki67（D）、T细胞标记物CD3（E）、CD80（F）、巨噬细胞标记物IBA-1（G）分析γHV68.kGPCR感染BALB/c小鼠的皮下肿瘤和树突状细胞标志物CD11c（H）。还通过免疫组织化学染色用抗γHV68LANA（ORF72，潜伏抗原）（I）和vGAT（ORF75c，裂解抗原）（J）的抗体分析肿瘤。在原始图像的正下方（I）或紧挨着（J）放大框状区域。比例尺表示25μm。
图7
图7。人类卡波西肉瘤的血管生成和炎症特征。
通过H&E染色（A）和免疫组织化学染色，检测潜在核抗原LANA（B）抗体、内皮细胞CD31（C）标记物、增殖细胞Ki67（D）、T细胞CD3（E）、抗原呈递细胞CD80（F）、巨噬细胞IBA-1（G）和树突状细胞CD11c（H）标记物对人卡波西肉瘤病变的分析。显示了具有代表性的图像，比例尺表示25μm。
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