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.2015年6月24日15:479。
doi:10.1186/s12885-015-1489-1。

含缬氨酸蛋白（VCP）的药理学靶向诱导DNA损伤并选择性杀伤犬淋巴瘤细胞

玛丽·维·纳多 1, 查尔斯·里科 2, 梅拉·佐伊 三, 梅兰妮·维万科斯 4, 萨宾·菲利蒙 5, 玛丽莲·帕奎特 6, 德里克·博博姆 7
附属机构

含缬氨酸蛋白（VCP）的药理学靶向诱导DNA损伤并选择性杀伤犬淋巴瘤细胞

玛丽·维·纳多等。 BMC癌症. .

摘要

背景：含缬氨酸蛋白（VCP）是蛋白质稳态的关键介质，可能是多种癌症的有价值的治疗靶点。VCP的过度表达发生在许多癌症中，通常与恶性肿瘤和不良预后相关。在这里，我们分析了犬淋巴瘤中VCP的表达，并评估了其作为该病治疗靶点的潜力。

方法：用免疫印迹和免疫组织化学方法检测犬淋巴瘤中VCP的表达。用VCP抑制剂Eeyarestatin 1（EER-1）以不同浓度和时间处理犬淋巴瘤细胞株CLBL-1、17-71和CL-1，并通过台盼蓝排除法、TUNEL和caspase活性测定法评估其活性、通过碘化丙啶掺入法和FACS评估其增殖。通过免疫印迹和免疫荧光分析Lys48泛素和ER应激标记物（DDIT3）、自噬标记物（SQSTM1、MAP1LC3A）和DNA损伤标记物（γH2AFX）确定EER-1的作用机制。通过TRP53和磷酸化TRP53的免疫印迹和Cdkn1a mRNA的实时RT-PCR测量，评估TRP53/ATM依赖的信号通路活性。

结果：发现犬B细胞淋巴瘤中VCP的表达水平随分级而增加。与对照外周血单个核细胞相比，EER-1治疗优先杀死犬淋巴瘤细胞。EER-1处理CLBL-1细胞可诱导G1细胞凋亡和细胞周期阻滞。出乎意料的是，EER-1似乎没有通过诱导内质网应激或抑制有害自噬途径发挥作用。相反，γH2AFX的表达迅速而显著地增加，表明EER-1可能通过促进DNA损伤积累发挥作用。TRP53磷酸化和Cdkn1a mRNA水平的增加表明，TRP53/ATM DNA损伤反应途径对EER-1的反应被激活，可能有助于诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。

结论：这些结果与犬B细胞淋巴瘤中VCP的表达相关。EER-1对淋巴瘤细胞的选择性活性表明VCP将成为淋巴瘤治疗的临床有用的治疗靶点。我们进一步提出了以DNA修复反应为中心的EER-1作用机制，这可能对治疗用VCP抑制化合物的设计和表征具有重要意义。

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数字

图1
图1
犬淋巴瘤中VCP蛋白的表达。一对VCP进行免疫印迹分析。图中显示了具有代表性的斑点，每条通道代表一名患者的单个淋巴结或肿瘤样本。使用n进行定量分析 = 每个级别和类型4–9个肿瘤样本，并标准化为ACTB（β肌动蛋白）作为负载对照。数据以平均值（横杆）表示 ± SEM（误差条）。星号（*）表示统计上的显著差异(*P（P） < 0.05）。b条B细胞淋巴瘤与正常淋巴结的VCP免疫组化比较。c（c）PBMC中VCP的免疫印迹分析（信号强度 = 1.01个任意单位）和淋巴瘤细胞系（17–71、CL-1和CLBL-1）（平均信号强度 = 3.33任意单位）。高、中间和低指等级，T和B指淋巴瘤细胞亚型，LN = 正常淋巴结
图2
图2
VCP抑制降低犬淋巴瘤细胞的生存能力。用分级剂量的EER-1处理PBMC、CLBL-1、17-71和CL-1细胞48小时。通过台盼蓝排除法评估细胞活力。在1和2μM剂量下，活PBMC的比例显著高于CL-1细胞(第页 < 0.05和第页 < 分别为0.01）。在3、4和5μM时，存活PBMC的比例显著高于CLBL-1、17-71或CL-1细胞(第页 < 每个细胞系和每个抑制剂浓度为0.001）。数据以平均值表示 ± SEM（误差线），n个 = 每个处理重复4次。实验重复了三次，并显示了具有代表性的结果
图3
图3
VCP抑制诱导犬淋巴瘤细胞株凋亡。一用载体（左图）、1μM（中图）和3μM（右图）的EER-1处理后对CLBL-1细胞进行的TUNEL测定的代表性图像。活细胞呈蓝色（DAPI信号），凋亡细胞呈紫色（合并的红色TUNEL信号 + DAPI）。b条TUNEL分析的定量分析。c（c）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性测定。数据以平均值（列）表示 ± SEM（误差条）。星号表示统计上的显著差异(*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01或***P（P） < 0.001）。对于这两个实验，n个 = 每个处理重复3次，每个实验重复三次，结果具有代表性
图4
图4
VCP抑制导致G1细胞周期阻滞.一车用处理（白柱）或EER-1处理（黑柱）细胞的碘化丙锭掺入/FACS分析。细胞按下文和方法部分所述进行选通和计数，并分组为G0/G1期或S/G2/M期。数据表示为平均值（列） ± SEM（误差线），n个 = 3次分析/治疗。星号表示统计上的显著差异(P（P） < 0.001）。实验重复了三次，并给出了具有代表性的结果。b条代表性双参数点位（FL2-A（面积）vs宽度）；灰色矩形表示FACS实验中分析的细胞数量。处理车辆的代表性FACS分析(c（c）)和EER-1处理(d日)单元格。灰色箭头表示被定义为G0/G1、S和G2/M的种群
图5
图5
VCP抑制诱导Lys48多泛素化蛋白和γH2AFX同时增加。一)用3μM EER-1处理CLBL-1细胞，进行Lys48泛素、γH2AFX、MAP1LC3A、SQSTM1和DDIT3的免疫印迹分析。图中显示了代表性的斑点，每条通道代表从单个井中采集的细胞。b条)定量分析使用n个 = 每个条件重复3次，并归一化为ACTB（βactin）作为负荷控制。数据以平均值（列）表示 ± SEM（误差条）。星号表示统计上的显著差异(*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001）。车辆 = 车辆。实验重复了三次，并显示了具有代表性的结果
图6
图6
VCP抑制导致核Lys48泛素蛋白积累和DNA损伤。用或不用3μM EER-1培养细胞12 h。对经处理（右面板）和未经处理（左面板）的细胞进行Lys48泛素和γH2AFX共免疫标记。进行阴性对照，不含初级抗体（未显示）
图7
图7
EER-1治疗导致犬淋巴瘤细胞中TRP53通路激活。CLBL-1细胞在加入或不加入3μM EER-1的情况下培养6、12或24小时。一磷酸化TRP53（Ser 15）和总TRP53的免疫印迹分析。图中显示了代表性的斑点（上部面板），每条通道代表单个井的细胞。使用以下方法对磷酸化TRP53/总TRP53比率（下面板）进行定量分析n个 = 每个条件重复3次。b条Cdkn1a型实时PCR分析mRNA表达。数据表示为平均值（列） ± SEM（误差条）。星号表示统计上的显著差异(**P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001）。实验重复了三次，并显示了具有代表性的结果
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