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.2015;14(18):2969-84.
doi:10.1080/15384101.2015.1056948。 Epub 2015年6月23日。

应激激活OCT4A在足叶乙甙作用下胚胎癌细胞命运决定中的作用

安达·胡纳 1, 克里斯汀·萨尔米娜 1, 叶卡捷琳娜·埃伦普雷萨 1, 亚历杭德罗·巴斯克斯-马丁 1, 杰卡布斯·克里格茨 1, Inna Inashkina酒店 1, Bogdan I Gerashchenko博士 1 2, 保罗·汤森 三, 马克·S·克拉格 4, 托马斯·杰克逊 三
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应激激活OCT4A在足叶乙甙作用下胚胎癌细胞命运决定中的作用

安达·胡纳等。 细胞周期. 2015.

摘要

最近发现，由基因毒性治疗引起的肿瘤细胞衰老与“干细胞”的诱导有着矛盾的联系。这一观察至关重要，因为它直接影响了肿瘤对当前放化疗治疗方案的反应。此前，我们发现，在足叶乙甙（ETO）治疗后，胚胎癌PA-1细胞经历了OCT4A和p21Cip1的p53依赖性上调（分别控制自我更新和调节细胞周期抑制和衰老）。在这里，我们报告了这些与其他关键细胞脂肪调节器之间关系的进一步细节。用ETO处理的PA-1细胞显示出OCT4A和p21Cip1的高度异质性增加，表明适应障碍。沉默OCT4A抑制p21Cip1，改变细胞周期调控，随后抑制终末期衰老；p21Cip1沉默不影响OCT4A的表达或细胞表型。ETO处理后SOX2和NANOG表达没有改变，表明OCT4A与其多能性功能分离。相反，ETO诱导的OCT4A伴随着AMPK的激活，AMPK是代谢应激和自噬调节的关键成分。p16ink4a是终末期衰老的诱导剂，在ETO处理的细胞的细胞质中经历了自噬隔离，允许细胞命运交替。因此，自噬失败伴随着p16ink4a的积累、核解体和细胞恢复的丧失。总之，这些发现表明，PA-1细胞DNA损伤后OCT4A的诱导通过调节p21Cip1的表达来实现细胞应激，而不是自我更新功能，而p21Cip与AMPK一起有助于调节自噬。此外，这些数据表明，通过持续的DNA损伤导致的自噬衰竭是细胞最终衰老的原因。

关键词：DNA损伤；OCT4A/POU5F1；细胞脂肪酸；p16ink4a；p21Cip1；p53；第62页；多能性；自我更新；衰老；肿瘤细胞。

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数字

图1。
图1。
ETO处理的PA-1细胞的衰老样表型。用8µM ETO处理PA-1细胞20 h，然后用新鲜培养基替换。(A-D公司)在指定的时间点用甲苯胺蓝染色评估DNA含量和核面积。(A类)指定时间点的甲苯胺蓝染色细胞核图像。(B类)制作DNA含量直方图并用于确定单个细胞的细胞周期阶段。(C类)DNA含量与细胞核面积的斑点，每个细胞根据DNA含量直方图确定的细胞周期阶段着色：G1（蓝色）；S相（绿色）；G2（红色）；紫色（多倍体）。在G2和多倍体组分中，经处理和未经处理的细胞之间的细胞核大小存在统计学显著差异（*p<0.05，n=3）。(E类)通过流式细胞术在指定的时间点测量细胞的颗粒度（SSC）。(F类)PA-1细胞的相差显微镜显示扁平形态。(G公司)p16ink4a的免疫荧光染色（红色），并在指定的时间点用DAPI进行复染，显示ETO治疗后p16ink4 a增加。(H（H）)通过图像细胞术测定单个细胞中p16ink4a表达的定量，显示为方框图，显示ETO治疗后其增加。图像代表了至少3个单独的实验。
图2。
图2。
ETO处理PA-1细胞后OCT4A和p21Cip1的表达。(A类)ETO处理后3d，免疫荧光双重染色OCT4A和p21cip1。(B类)通过图像细胞术测定ETO治疗后第3天和第5天OCT4A和p21Cip1表达的定量。(C类)ETO治疗后用流式细胞术检测OCT4A和p21Cip1。11天以上收集的数据表明，表达和异质性增加，在最大增加时（第5天）有大量双阳性细胞。从第7天开始，随着克隆生长的恢复，双阳性群体和异质性程度逐渐降低。
图3。
图3。
PA-1细胞对ETO处理反应的多能性转录因子分析。(A类)在ETO治疗后的指定时间点，通过免疫印迹分析p53、p21Cip1、OCT4A、SOX2和NANOG的蛋白表达。GAPDH作为负荷对照，NT2细胞作为多能性基因OCT4A、SOX2和NANOG的阳性对照。在DNA损伤反应中，p53和p2Cip1蛋白表达上调。ETO治疗后第1天检测到OCT4A蛋白上调，而SOX2在ETO表达后保持低水平和不变。在NT或ETO处理的PA-1细胞中未检测到NANOG。3个独立实验的结果具有代表性。(B类)对单个细胞的细胞核进行SOX2表达的半自动图像细胞术。方框图显示了所测量的异质性和表达水平。数据显示，SOX2对ETO治疗仍无反应。
图4。
图4。
OCT4A抑制p21、G2阻滞并诱导衰老。PA-1细胞用ntg-siRNA或OCT4-siRNA处理24小时，然后用8µM ETO处理20小时，并用新鲜培养基替换。(A类)通过免疫印迹法在指定时间点评估蛋白质表达。制作细胞裂解物，并通过免疫印迹法对pCHK2、RAD51、p53、p21Cip1、OCT4A和GAPDH进行评估，作为负荷对照。(B类)细胞固定，PtdIns染色，流式细胞仪分析。经ntg-siRNA处理和OCT4-siRNA处理的细胞在ETO处理后均发生G2M阻滞，这在OCT4A-siRNA处理细胞的第3天和第5天更为严重。随后，OCT4A-siRNA处理的细胞中的细胞死亡程度（亚G1）要低得多。(C类)G2M阻滞是根据DNA直方图计算的，如(B类)OCT4A沉默细胞中的水平显著升高（*p<0.05，n=3）。(D类)如上所述，用ETO处理PA-1细胞，并在5天后评估Sa-β-gal活性，根据Sa-β-gal活性监测衰老，通过OCT4A沉默增加衰老。经ntg siRNA和OCT4A siRNA处理的细胞在ETO处理后均变大，但未沉默的细胞缺乏Sa-β-gal活性。
图5。
图5。
OCT4A沉默抑制ETO处理的PA-1细胞的克隆恢复。用ntg-siRNA或OCT4A-siRNA处理PA-1细胞24小时，然后用8µM ETO处理20小时，并用新鲜培养基替换。细胞维持到第11天。在非沉默细胞中观察到克隆恢复，但在OCT4A沉默细胞中未观察到克隆回复，该细胞保持了扁平的衰老样形态。(B类)细胞固定，PI染色，流式细胞仪分析。在非沉默的ntg细胞中观察到G1峰的恢复，而OCT4A沉默的细胞保持了G2的深度阻滞。OCT4A沉默的细胞进入了一轮内复制，基因组大到32C。
图6。
图6。
p21Cip1的表达并不影响ETO处理PA-1细胞后G2M的阻滞。PA-1细胞用ntg-siRNA或p21Cip1-siRNA处理24 h，然后用8µM ETO处理20 h，并用新鲜培养基替换。(A类)通过免疫印迹法在指定时间点评估OCT4A、p21Cip1和p53的表达。GAPDH被用作负荷控制。(B类)细胞固定，PtdIns染色，流式细胞术分析。经ntg-siRNA处理和p21Cip1-siRNA处理的细胞在ETO处理后发生了类似的G2M阻滞。(C类)p21Cip1沉默细胞和非沉默细胞的G2M阻滞无显著差异。
图7。
图7。
激活AMPK和OCT4A以响应ETO治疗。用8µM ETO处理PA-1细胞20 h，并用新鲜培养基替换。在OCT4A、pAMPK免疫荧光染色前4天采集细胞Thr172电话和DAPI。(A类)比较了未处理（上面板）和ETO处理（下面板）样品。在间期细胞中，AMPK和OCT4均被ETO激活（第4天），但pAMPK位于阻滞中期的多个中心体中，而OCT4A则没有；(B类)在第4天评估单个细胞中OCT4A和pAMPK的图像细胞散点图。OCT4A和pAMPK的表达增强之间有明显的相关性Thr172电话ETO处理的细胞；(C类)OCT4A和pAMPKThr172电话ETO处理4天后PA-1细胞的免疫荧光。OCT4A和pAMPKThr172电话主要在相同的间期细胞核中表达，但在凋亡细胞中发现pAMPK而不是OCT4A的极高信号。pAMPK染色Thr172电话与常染色质相关，而OCT4A染色模式为核质（不与染色质结合）。BRG–一种3波段滤光器。棒材=20µm。
图8。
图8。
ETO治疗后大细胞自噬的评估（第4天）。用8µM ETO处理PA-1细胞20 h，并在有或无Baf的情况下用新鲜培养基替换。然后对细胞进行p62染色，计算每个细胞中p62阳性小体的数量。(A类)p62染色的免疫荧光示例显示对照细胞和ETO处理细胞中的病灶（p62小体）。(B类)p62小体/细胞的代表性直方图。(C类)通过3个独立实验（*p<0.05，n=3）比较了NT和ETO处理的细胞每个细胞p62小体的平均数量，表明细胞通过自噬激活。(D类)ETO治疗后使用和不使用Baf治疗的LC3A和LC3B比率的免疫印迹分析。Baf处理后LC3B水平相对于LC3A的增强表明ETO处理细胞中自噬通量的中断。棒材=20µm。
图9。
图9。
ETO处理的PA-1细胞中自噬功能与衰老标志物p16ink4之间的关系。在去除培养基并用新鲜培养基替换之前，用8µM ETO处理PA-1细胞20 h，不使用或使用Baf；48h后（第4天）收获细胞。(A、 B类)p16ink4a（红色）、LAMP2（绿色）或DAPI（蓝色）的荧光染色。(A类)如BRG光学滤波器所示(B类)只有LAMP2的绿色滤光片显示出高水平的功能性自噬隔离p16ink4a-含有攻击性蛋白。(B、 C类)显示自噬失败的示例，其中(B类)p16ink4a的隔离部分丢失，扩散到细胞质中，而(C类)自噬功能障碍的证据是一个大液泡中过量存在未消化的p16ink4a。在这三种情况下，细胞核都受损：(B类)“蕾丝”；(C类)被一个巨大的自噬空泡移位和扭曲，细胞核中有一些DNA丢失。这些过程在ETO处理的(B类)更常见于ETO+BAF（c）处理的细胞。(D类)这张图片显示了ETO乳头标本中用甲苯胺蓝对DNA进行特殊染色的正常和镰状细胞核（镰状细胞核用箭头表示）。
图10。
图10。
ETO和ETO+Baf损害细胞核完整性，导致一部分具有持续DNA损伤的细胞的S期晚期延迟。(A类)在长期暴露Baf（72小时）后，ETO处理的细胞中观察到细胞核解体，在没有LC3病灶的情况下，LC3B阳性细胞质的肺泡结构证实自噬通量受损；棒材=20µm。(B类)持续的DNA损伤导致前染色质三元复合物（连接到层粘连B1的核小体的一种特殊构象）的破坏，表现为Pl2-6抗体染色减少，在第4天ETO处理的PA1细胞中检测到Chk2-阳性病灶。(C类)通过ETO处理的和ETO+BAF处理的细胞样品的图像细胞术获得的代表性DNA直方图（处理后第4天）；三个独立实验之一。BafA单独导致对照（NT）细胞G1部分阻滞，随后G2部分减少；ETO治疗可诱导G2复发，但有一部分细胞在晚期S期（<4C）仍然延迟。DNA含量<4C和4C（G2）的细胞仍会达到相应倍增、<8C和8C的峰值。在ETO处理的细胞中，Baf抑制自噬有助于增加<4C部分的细胞比例，并减少细胞数量。
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中的注释

  • OCT4A和DNA损伤反应。
    Murray D，Mirzayans R。 Murray D等人。 细胞周期。2015;14(18):2871-2. doi:10.1080/15384101.2015.1069507。Epub 2015年7月15日。 细胞周期。2015 PMID：26177300 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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