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.2015年12月;62(6):1847-57.
doi:10.1002/1993年9月27日。 Epub 2015年7月31日。

受体相互作用蛋白激酶1介导小鼠对乙酰氨基酚的毒性,不依赖于坏死体,而不是通过坏死

附属公司

受体相互作用蛋白激酶1介导小鼠对乙酰氨基酚毒性,不依赖于坏死体而不是通过坏死性下垂

莉莉·达拉等。 肝病学. 2015年12月.

摘要

虽然已知对乙酰氨基酚(APAP)模型中的坏死是由c-Jun NH2-末端激酶(JNK)通过与线粒体的相互作用调节的,但也提出了通过受体相互作用蛋白1和3(RIPK1和RIPK3)的坏死作用。我们的目的是确定这两种细胞死亡机制之间的关系。为了验证RIPK1的参与,我们在体内和体外使用了反义敲除并证实了与RIPK1抑制剂坏死抑制素类似的保护作用。然而,我们没有发现证据表明在基础条件下或APAP和RIPK3(-/-)小鼠未受保护后,RIPK3在原代小鼠肝细胞中表达。RIPK3仅在非实质细胞中表达。RIPK1敲除对RIPK3(-/-)小鼠的保护程度与野生型小鼠相同,突显了RIPK1的独立作用。我们通过使用未受APAP保护的混合谱系激酶域样蛋白(MLKL)敲除小鼠,证实了坏死与APAP毒性无关。接下来,我们讨论了RIPK1和JNK之间是否存在相互作用。RIPK1基因敲除降低了JNK激活水平和线粒体易位水平,并消除了随后的动力相关蛋白1(Drp1)易位。有趣的是,APAP诱导RIPK1向线粒体移位,而线粒体JNK对接蛋白Sh3同源性3结合蛋白5(Sab)的敲除不影响RIPK1的移位。

结论:RIPK1参与APAP诱导的JNK激活上游的坏死,而RIPK3和MLKL是可有可无的,这表明坏死性凋亡并不参与APAP诱发的坏死,RIPK1具有独特、独立的作用。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。RIPK1基因敲除对APAP体内毒性的影响
用RIPK1或对照ASO(50 mg/kg)治疗小鼠五次,随后注射APAP 300 mg/kg,并于24小时处死。(A)血清ALT(U/L),(插图,Western blot显示蛋白敲除)。N=12每组*第页值≤0.05 RIPK1对照组ASO处理小鼠。(B) 代表性组织学H&E(10x);(C) NAPQI加合物的Western blot和密度测定。N=3;(D) 用RIPK1或对照ASO治疗小鼠,随后注射500 mg/kg APAP,并随访72小时以评估存活率。两个独立实验的结果N=每组8个;RIPK1对数秩P值<0.001。
图1
图1。RIPK1基因敲除对APAP体内毒性的影响
用RIPK1或对照ASO(50 mg/kg)治疗小鼠五次,随后注射APAP 300 mg/kg,并于24小时处死。(A)血清ALT(U/L),(插图,Western blot显示蛋白敲除)。N=12每组*第页值≤0.05 RIPK1对照组ASO处理小鼠。(B) 代表性组织学H&E(10x);(C) NAPQI加合物的Western blot和密度测定。N=3;(D) 用RIPK1或对照ASO治疗小鼠,随后注射500 mg/kg APAP,并随访72小时以评估存活率。两个独立实验的结果,每组N=8;RIPK1对数秩P值<0.001。
图1
图1。RIPK1基因敲除对APAP体内毒性的影响
用RIPK1或对照ASO(50 mg/kg)治疗小鼠五次,随后注射APAP 300 mg/kg,并于24小时处死。(A)血清ALT(U/L),(插图,Western blot显示蛋白敲除)。N=12每组*第页值≤0.05 RIPK1对照组ASO处理小鼠。(B) 代表性组织学H&E(10x);(C) NAPQI加合物的Western blot和密度测定。N=3;(D) 用RIPK1或对照ASO治疗小鼠,随后注射500 mg/kg APAP,并随访72小时以评估存活率。两个独立实验的结果,每组N=8;RIPK1对数秩P值<0.001。
图2
图2。RIPK1易位到线粒体
(A) 用RIPK1或对照ASO治疗小鼠,随后注射300 mg/kg APAP,并在指定的时间点实施安乐死。RIPK1细胞质组分的Western blot和密度测定;(B) 线粒体RIPK1组分的Western blot和密度测定;N=每组每个时间点3只小鼠*第页值≤0.05 APAP控制#,第页值≤0.05 RIPK1 ASO与对照ASO。(C) PBS后PMH中RIPK1和COXIV的共定标APAP10 mM,2小时(64倍放大)。绿色:细胞色素氧化酶IV,红色:RIPK1,黄色:共定位,蓝色:DAPI核染色。
图2
图2。RIPK1易位到线粒体
(A) 用RIPK1或对照ASO治疗小鼠,随后注射300 mg/kg APAP,并在指定的时间点实施安乐死。RIPK1细胞质组分的Western blot和密度测定;(B) 线粒体RIPK1组分的Western blot和密度测定;N=每组每个时间点3只小鼠*第页值≤0.05 APAP控制编号,第页值≤0.05 RIPK1 ASO与控制ASO。(C) PBS后PMH中RIPK1和COXIV的共定标APAP10 mM,2小时(64倍放大)。绿色:细胞色素氧化酶IV,红色:RIPK1,黄色:共定位,蓝色:DAPI核染色。
图3
图3。RIPK3在肝细胞中的表达
用PBS或APAP 300 mg/kg治疗WT小鼠3和6小时,用APAP治疗RIPK3−/−小鼠6小时。(B) 免疫印迹显示RIPK3的肝细胞分数和阳性(第1道)和阴性对照(第2道)。50 ug新鲜分离的未经处理的PMH(第3道)或在Western blot(第4道)前用10 mM APAP处理6小时,15 ug从对照组(第5道)或APAP(300 mg/kg)处理小鼠分离的Kupffer细胞3小时(第6道),15 ugs从使用淘洗的对照组小鼠分离的LSEC(第7道),10 ug总肝白细胞(第8道)野生型脾脏10 ug(lane 9)。Ponceau染色显示蛋白质负荷用于比较,GAPDH负荷用于PMH Con和APAP 6小时。NS:非特异性。
图3
图3。RIPK3在肝细胞中的表达
用PBS或APAP 300 mg/kg治疗WT小鼠3和6小时,用APAP治疗RIPK3−/−小鼠6小时。(B) 免疫印迹显示RIPK3的肝细胞分数和阳性(第1道)和阴性对照(第2道)。50 ug新鲜分离的未经处理的PMH(第3道)或在Western blot(第4道)前用10 mM APAP处理6小时,15 ug从对照组(第5道)或APAP(300 mg/kg)处理小鼠分离的Kupffer细胞3小时(第6道),15 ugs从使用淘洗的对照组小鼠分离的LSEC(第7道),10 ug总肝白细胞(第8道)野生型脾脏10 ug(lane 9)。Ponceau染色显示蛋白质负荷用于比较,GAPDH负荷用于PMH Con和APAP 6小时。NS:非特异性。
图4
图4。RIPK1敲除和抑制对RIPK3−/−小鼠和肝细胞的影响
(A) 隔夜禁食的WT和RIPK3−/−小鼠用APAP 300 mg/kg治疗,6小时后处死。每组N=12,ALT(U/L);(B) RIPK3−/−和WT对照组给予对照组ASO或RIPK1 ASO五个剂量,然后注射300 mg/kg APAP,并在24小时时安乐死,ALT(U/L),*P<0.05 RIPK1 vs对照组ASO;(C) 24小时(10x)时的典型组织学(H&E)。结果为平均值±S.D,对于B&C,每组至少N=12;(D) 经20 mM APAP治疗2小时后,WT小鼠与RIPK3−/−小鼠PMH的存活率。随后更换介质,并添加Nec-1或DMSO。结果为平均值±标准偏差,N=3*P<0.05。
图4
图4。RIPK1敲除和抑制对RIPK3−/−小鼠和肝细胞的影响
(A) 隔夜禁食的WT和RIPK3−/−小鼠用APAP 300 mg/kg治疗,6小时后处死。每组N=12,ALT(U/L);(B) RIPK3−/−和WT对照组给予对照组ASO或RIPK1 ASO五个剂量,然后注射300 mg/kg APAP,并在24小时时安乐死,ALT(U/L),*P<0.05 RIPK1 vs对照组ASO;(C) 24小时(10x)时的典型组织学(H&E)。结果为平均值±S.D,对于B&C,每组至少N=12;(D) 经20 mM APAP治疗2小时后,WT小鼠与RIPK3−/−小鼠PMH的存活率。随后更换介质,并添加Nec-1或DMSO。结果为平均值±标准偏差,N=3*P<0.05。
图4
图4。RIPK1敲除和抑制对RIPK3−/−小鼠和肝细胞的影响
(A) 隔夜禁食的WT和RIPK3−/−小鼠用APAP 300 mg/kg治疗,6小时后处死。每组N=12,ALT(U/L);(B) RIPK3−/−和WT对照组给予对照组ASO或RIPK1 ASO五个剂量,然后注射300 mg/kg APAP,并在24小时时安乐死,ALT(U/L),*P<0.05 RIPK1 vs对照组ASO;(C) 24小时(10x)时的典型组织学(H&E)。结果为平均值±S.D,对于B&C,每组至少N=12;(D) 经20 mM APAP治疗2小时后,WT小鼠与RIPK3−/−小鼠PMH的存活率。随后更换介质,并添加Nec-1或DMSO。结果为平均值±标准偏差,N=3*P<0.05。
图4
图4。RIPK1敲除和抑制对RIPK3−/−小鼠和肝细胞的影响
(A) 隔夜禁食的WT和RIPK3−/−小鼠用APAP 300 mg/kg治疗,6小时后处死。每组N=12,ALT(U/L);(B) RIPK3−/−和WT对照组给予对照组ASO或RIPK1 ASO五个剂量,然后注射300 mg/kg APAP,并在24小时时安乐死,ALT(U/L),*P<0.05 RIPK1 vs对照组ASO;(C) 24小时(10x)时的典型组织学(H&E)。结果为平均值±S.D,对于B&C,每组至少N=12;(D) 经20 mM APAP治疗2小时后,WT小鼠与RIPK3−/−小鼠PMH的存活率。随后交换培养基并加入Nec-1或DMSO。结果为平均值±标准差,N=3*P<0.05。
图5
图5。肝细胞中MLKL的表达和MLKL−/−中APAP的毒性
(A) 肝细胞组分和BALB成纤维细胞裂解物的MLKL、β-肌动蛋白和GAPDH的免疫印迹(可变负载)。MLKL的阳性对照(通道1,10 ug)和阴性对照(通道2,50 ug)。在Western blot(第4道)之前,新鲜分离出未经处理的PMH(第3道,30 ug)或用APAP 10 mM体外处理6小时,从对照组(第5道,10 ug)和APAP(300 mg/kg)处理的小鼠分离出Kupffer细胞3小时(第6道,10μg),使用淘洗法从对照组小鼠分离出LSEC(第7道,10微克),总肝白细胞(第8道,5微克),野生型脾脏(9号线,5 ug)和MLKL−/−脾脏(10号线,15 ug)。Ponceau染色用于蛋白质负荷,用于不同细胞之间的比较。(B) 隔夜禁食的WT和MLKL−/−小鼠用APAP 300 mg/kg治疗,24小时后安乐死,ALT(U/L)(插图,Western blot显示蛋白敲除)。结果平均值为±S.D,每组N=5;(C) 24小时(10X)时的典型组织学(H&E)。
图5
图5。肝细胞中MLKL的表达和MLKL−/−中APAP的毒性
(A) 肝细胞组分和BALB成纤维细胞裂解物的MLKL、β-肌动蛋白和GAPDH的免疫印迹(可变负载)。MLKL的阳性对照(通道1,10 ug)和阴性对照(通道2,50 ug)。在Western blot(第4道)之前,新鲜分离出未经处理的PMH(第3道,30 ug)或用APAP 10 mM体外处理6小时,从对照组(第5道,10 ug)和APAP(300 mg/kg)处理的小鼠分离出Kupffer细胞3小时(第6道,10μg),使用淘洗法从对照组小鼠分离出LSEC(第7道,10微克),总肝白细胞(第8道,5微克),野生型脾脏(9号线,5 ug)和MLKL−/−脾脏(10号线,15 ug)。Ponceau染色用于蛋白质负荷,用于不同细胞之间的比较。(B) 隔夜禁食的WT和MLKL−/−小鼠用APAP 300 mg/kg治疗,24小时后安乐死,ALT(U/L)(插图,Western blot显示蛋白敲除)。结果平均值为±S.D,每组N=5;(C) 24小时(10X)时的典型组织学(H&E)。
图6
图6。RIPK1与JNK激活和DRP1转移的关系
用RIPK1或对照ASO治疗小鼠,随后注射300 mg/kg APAP,并在指定时间点实施安乐死;(A) 细胞质P-JNK、总JNK和β-肌动蛋白的蛋白质印迹和密度测定;(B) 线粒体部分对p-JNK和PHB1的蛋白质印迹和密度测定;(C) 对照组和RIPK1 ASO处理小鼠线粒体部分的蛋白质印迹用于Drp1和密度测定;N=每组每个时间点3只小鼠*第页值<0.05 APAP控制#第页值<0.05 RIPK1 ASO与对照ASO;(D) 腺病毒shSab与shLacZ治疗小鼠线粒体部分Drp1的Western blot比较。(E) 腺病毒shSab与shLacZ处理小鼠RIPK1线粒体部分的Western blot比较。
图6
图6。RIPK1与JNK激活和DRP1转移的关系
用RIPK1或对照ASO治疗小鼠,随后注射300 mg/kg APAP,并在指定时间点实施安乐死;(A) 细胞质P-JNK、总JNK和β-肌动蛋白的蛋白质印迹和密度测定;(B) 线粒体部分对p-JNK和PHB1的蛋白质印迹和密度测定;(C) 对照组和RIPK1 ASO处理小鼠线粒体部分的蛋白质印迹用于Drp1和密度测定;N=每组每个时间点3只小鼠*第页值<0.05 APAP控制#第页值<0.05 RIPK1 ASO与对照ASO;(D) 腺病毒shSab与shLacZ治疗小鼠线粒体部分Drp1的Western blot比较。(E) 腺病毒shSab与shLacZ处理小鼠RIPK1线粒体部分的Western blot比较。
图6
图6。RIPK1与JNK激活和DRP1转移的关系
用RIPK1或对照ASO治疗小鼠,随后注射300 mg/kg APAP,并在指定时间点实施安乐死;(A) 细胞质P-JNK、总JNK和β-肌动蛋白的蛋白质印迹和密度测定;(B) 线粒体部分对p-JNK和PHB1的蛋白质印迹和密度测定;(C) 对照组和RIPK1 ASO处理小鼠线粒体部分的蛋白质印迹用于Drp1和密度测定;N=每组每个时间点3只小鼠*第页值<0.05 APAP控制#第页值<0.05 RIPK1 ASO与对照ASO;(D) 腺病毒shSab与shLacZ治疗小鼠线粒体部分Drp1的Western blot比较。(E) 腺病毒shSab与shLacZ处理小鼠RIPK1线粒体部分的Western blot比较。
图6
图6。RIPK1与JNK激活和DRP1转移的关系
用RIPK1或对照ASO治疗小鼠,随后注射300 mg/kg APAP,并在指定时间点实施安乐死;(A) 细胞质P-JNK、总JNK和β-肌动蛋白的蛋白质印迹和密度测定;(B) 线粒体部分对p-JNK和PHB1的蛋白质印迹和密度测定;(C) 对照组和RIPK1 ASO处理小鼠线粒体部分的蛋白质印迹用于Drp1和密度测定;N=每组每个时间点3只小鼠*第页值<0.05 APAP控制#第页值<0.05 RIPK1 ASO与对照ASO比较;(D) 腺病毒shSab与shLacZ处理的小鼠的Drp1线粒体部分的蛋白质印迹。(E) 腺病毒shSab与shLacZ处理小鼠RIPK1线粒体部分的Western blot比较。

中的注释

  • 醋氨酚敲开死亡之门,受体相互作用蛋白1激酶应答。
    Guicciardi ME、Gores GJ、Jaeschke H。 Guicciardi ME等人。 肝病学。2015年12月;62(6):1664-6. doi:10.1002/hep.28107。Epub 2015年9月30日。 肝病学。2015 PMID:26251116 免费PMC文章。 没有可用的摘要。
  • 肝细胞中的受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)不介导小鼠对乙酰氨基酚毒性。
    Schneider AT、Gautheron J、Tack F、Vucur M、Luedde T。 施耐德AT等人。 肝病学。2016年7月;64(1):306-8. doi:10.1002/hep.28225。Epub 2015年12月18日。 肝病学。2016 PMID:26389825 没有可用的摘要。
  • 回复。
    Dara L,Kaplowitz N。 Dara L等人。 肝病学。2016年7月;64(1):308-9. doi:10.1002/hep.28221。Epub 2015年10月23日。 肝病学。2016 PMID:26390377 没有可用的摘要。
  • 回复。
    Dara L,Kaplowitz N。 Dara L等人。 肝病学。2016年7月;64(1):312-3. doi:10.1002/hep.28262。Epub 2016年2月19日。 肝病学。2016 PMID:26418131 没有可用的摘要。
  • RIPK1-RIPK3-MLKL介导的对乙酰氨基酚肝毒性坏死的结束?
    杨X、赵X、王中通、丁伟X。 Yang X等人。 肝病学。2016年7月;64(1):311-2. doi:10.1002/hep.28263。Epub 2015年12月18日。 肝病学。2016 PMID:26418225 没有可用的摘要。

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    1. Larson AM、Polson J、Fontana RJ、Davern TJ、Lalani E、Hynan LS、Reisch JS等。对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭:美国多中心前瞻性研究结果。肝病学。2005年;42:1364–1372.-公共医学
    1. Boess F、Bopst M、Althaus R、Polsky S、Cohen SD、Eugster HP、Boelsterli UA。肿瘤坏死因子/淋巴毒素-α基因敲除小鼠的对乙酰氨基酚肝毒性。肝病学。1998;27:1021–1029.-公共医学
    1. Jaeschke H,Cover C,Bajt ML。半胱氨酸蛋白酶在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中的作用。生命科学。2006;78:1670–1676.-公共医学
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