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.2015年8月：34:415-22。
doi:10.1016/j.meegid.2015.06.008。 Epub 2015年6月9日。

PI3K/Akt/p53通路抑制呼肠孤病毒感染

张晓战 1, 吴红霞 1, 刘忠国 1, 金田 2, 连东区 三
附属公司

PI3K/Akt/p53通路抑制呼肠孤病毒感染

张晓战等。 感染基因进化. 2015年8月.

摘要

病毒感染激活了许多宿主信号通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt通路，由于其在调节病毒复制中的核心作用，最近引起了人们的极大兴趣。本研究表明，血清型3呼肠孤病毒株Masked Palm Civet/China/2004（MPC/04）能够在感染早期瞬时激活A549细胞中的PI3K/Akt通路。阻断PI3K/Akt激活可增加病毒RNA的合成和产量。进一步分析了PI3K/Akt下游效应物MDM2/p53在调节呼肠孤病毒复制中的作用。我们发现，在呼肠孤病毒感染期间，磷酸化MDM2（p-MDM2）水平升高，p53表达降低。此外，Ly294002阻断PI3K/Akt或siRNA敲除Akt可降低p-MDM2水平，增加p53水平。两者均表明PI3K/Akt下游效应器MDM2/p53被激活。Nutlin预处理可以破坏MDM2和p53的串扰，增加p53 RNA和蛋白的表达，剂量依赖性地增强呼肠孤病毒的复制。此外，仅p53的过度表达也支持呼肠孤病毒的复制，而p53的敲除显著抑制了病毒的复制。本研究表明，哺乳动物呼肠孤病毒激活的PI3K/Akt/p53可以作为抑制病毒复制/感染的途径，但该过程的确切机制仍有待进一步研究。

关键词：MDM2；PI3K/Akt；呼肠孤病毒；复制；第53页。

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数字

图1
图1
A549细胞中Akt磷酸化的测定。（A） –（C）用MOI为5（B）的活MPC/04（A）感染血清饥饿的A549细胞，用紫外线处理的MPC/04或（C）模拟病毒感染。在指定的时间点用蛋白质印迹法检测磷酸化Akt和总Akt水平。（D） 和（E）血清饥饿的A549细胞与LY294002（LY；10-50μM）（D）、Wortmannin（Wort；100 nM-1μM）或DMSO（0.4%，v/v）预先孵育1小时，然后在MOI为5时感染MPC/04。每个面板中都包含模拟感染车道作为阴性对照。30分钟后，通过western blots检测磷酸化Akt和总Akt水平。（F） A549电池（105)用靶向p85或阴性siRNA的50 nM siRNA转染，然后在转染后24小时以5的MOI感染MPC/04。感染后30分钟测定p-Akt、总Akt，p85和GAPDH的表达。这些数据代表了三个独立实验的结果。
图2
图2
阻断PI3K/Akt通路可促进呼肠孤病毒复制。（A） –（D）将血清饥饿的A549细胞与增加浓度的LY294002（A和C）、Wortmannin（B和D）或DMSO预先孵育1小时，然后在MOI为5时感染MPC/04。每次注射24小时后，通过实时PCR（A和B）分析病毒S4基因的相对表达，并采集细胞上清液以分析病毒滴度（C和D）。（E） 和（F）在MPC/04感染期间的指定时间点，以MOI为5，用LY294002（50μM）或DMSO接种血清饥饿的A549细胞。感染后24小时，通过实时PCR（E）分析S4基因的相对表达，并采集细胞上清液进行病毒滴度（F）分析。数据代表了三个独立实验的结果。*第页 < 0.05,**第页<0.001。误差条指示SD。
图3
图3
呼肠孤病毒感染期间MDM2和p53的检测。（A） 和（B）血清饥饿的A549细胞感染了MOI为5或模拟病毒的MPC/04。在指定的时间点采集呼肠孤病毒感染细胞的裂解物，用于磷酸化MDM2、总MDM2、p53和GAPDH的分析。（C） 将血清饥饿的A549细胞与LY294002（50μM）预孵育1 h，然后在MOI为5或模拟病毒的情况下感染MPC/04。每次24小时制备呼肠孤病毒感染细胞的裂解物，用于分析p-MDM2、MDM2，p53和GAPDH。（D） A549电池（105)用靶向Akt或阴性siRNA的50 nM siRNA转染，然后在转染24小时后以5倍的MOI感染MPC/04。感染后12 h测定p-MDM2、MDM2，p53、Akt和GAPDH的表达水平。数据代表了三个独立实验的结果。
图4
图4
Nutlin治疗促进呼肠孤病毒复制。（A） 和（B）将缺乏血清的A549细胞与不断增加的Nutlin或DMSO浓度预先孵育1 h，然后在药物存在的情况下，以5的MOI感染MPC/04 24 h。通过实时PCR（A）分析病毒S4基因的相对表达，并采集细胞上清液进行病毒滴度（B）分析。（C） 将缺乏血清的A549细胞与增加浓度的Nutlin或DMSO孵育24小时。实时PCR分析p53基因的相对表达。（D） 将血清饥饿的A549细胞与Nutlin（20μM）或DMSO孵育1小时，然后在每种药物存在的情况下以5倍的MOI感染MPC/04 24小时。制备呼肠孤病毒感染细胞的裂解物，用于分析p53和GAPDH（D）。（E） 和（F）在指定的时间点用Nutlin（20μM）或DMSO接种血清饥饿的A549细胞，然后在药物存在的情况下以5的MOI感染MPC/04 24小时。通过实时PCR（E）分析病毒S4基因的相对表达，并采集细胞上清液进行病毒滴度（F）分析。数据代表了三个独立实验的结果。*第页 < 0.05,**第页<0.001。误差条指示SD。
图5
图5
p53在呼肠孤病毒复制中的作用。（A） –（D）用表达p53或靶向p53的siRNA质粒转染A549细胞，然后在转染24小时后以5倍的MOI感染MPC/04。转染后24小时，通过实时PCR（A和C）分析病毒S4基因的相对表达。用western blots（A和C）检测p53的表达。测定病毒滴度（B和D）。（E） 和（F）在用靶向p53的siRNA转染后24小时，A549细胞在感染前接种Nutlin（20μM）或DMSO，然后在药物存在下以5的MOI感染MPC/04 24小时。通过实时PCR（E）分析病毒S4基因的相对表达，并采集细胞上清液进行病毒滴度（F）分析。数据代表三个独立实验的结果。*第页 < 0.05,**第页<0.001。误差条指示SD。
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