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.2015年8月；35(16):2771-89.
doi:10.1128/MCB.00181-15。 Epub 2015年6月8日。

高表达血清视黄醇结合蛋白的转基因小鼠通过视黄醇非依赖性机制发生进行性视网膜变性

梅杜 1, 劳拉·奥塔洛拉 1, 阿什利·A·马丁 1, 吉纳迪·莫西耶夫 1, 菲利普·范兰丁汉姆 2, 王琦龙 三, 拉斐尔·法乔 2, 亚历山大·叶加内赫 1, 亚历山大·基安堡 2, Krysten M Farjo公司 4
附属公司

过表达血清视黄醇结合蛋白的转基因小鼠通过一种与视黄醇无关的机制发展进行性视网膜变性

梅杜等。 分子细胞生物学. 2015年8月.

摘要

血清视黄醇结合蛋白4（RBP4）是血液中视黄醇的唯一特异性转运蛋白，但它也是一种脂肪因子，具有视黄醇非依赖性、促炎活性，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病相关。此外，两项独立的研究报告称，与轻度或无视网膜病变的患者相比，增殖性糖尿病视网膜病变患者的血清RBP4水平升高，但RBP4升高对视网膜的影响尚未研究。在这里，我们发现过度表达RBP4的转基因小鼠（RBP4-Tg小鼠）会发生进行性视网膜变性，其特征是光感受器带状突触缺陷和随后的双极细胞丢失。RBP4-Tg小鼠的眼部视黄醇和双视黄醇水平正常，这表明视黄醇诱导的依赖性机制是视网膜变性的基础。视网膜中前白细胞介素-18（pro-IL-18）mRNA和激活的IL-18蛋白的表达增加以及早期小胶质细胞的激活表明视网膜变性是由促炎机制驱动的。RBP4升高不需要慢性全身代谢疾病或其他视网膜损伤来促进视网膜神经退行性变，因为RBP4-Tg小鼠不具有一致的视网膜血管病理、肥胖、血脂异常或高血糖。这些发现表明，血清RBP4水平升高可能是非糖尿病患者和糖尿病患者视网膜损伤和视力下降的风险因素。

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数字

图1
图1
RBP4-Tg型小鼠的血清RBP4水平增加了10到6倍，并保持了正常的体重和空腹血糖、血清胰岛素和甘油三酯水平。（A） 小鼠血清中总（小鼠和人类转基因）RBP4水平(n个每个年龄段基因型组合≥4只小鼠；WT，野生型）。（B） 2个月龄小鼠血清中的TTR水平(n个每个基因型≥5只小鼠；数据由Student’st吨测试）。（C和D）禁食6小时的小鼠血糖水平(n个每次测量≥6只小鼠）。（E和F）禁食6小时的小鼠的体重测量(n个每次测量≥6只小鼠）。（G） 禁食6小时的9月龄小鼠血清中的胰岛素水平（根据Student’st吨测试）。（H） 禁食6小时的4月龄小鼠血清中的甘油三酯水平（根据Student’st吨测试）。（一） 禁食6小时的4个月龄小鼠血清中脂联素水平（根据Student’st吨测试）。（J和K）17至21周龄雄性小鼠的胰岛素耐受性试验结果(n个=每个基因型7至8只小鼠）禁食6小时，然后在时间零点一次性腹腔注射胰岛素（0.75单位/kg），然后在注射后0、15、30、60、90和120分钟测量血糖。所有图形值均为平均值±SEM。**，P（P）<0.01（按学生）t吨测试；***，P（P）<0.001（学生）t吨测试。
图2
图2
年视力显著下降RBP4-Tg型老鼠。6个月龄小鼠（野生型，野生型）灌流视网膜中的（A至C）RBP4和白蛋白水平(n个每个基因型≥5只小鼠）；（D和E）OKT对空间频率变化的响应；（F和G）OKT对光栅对比度变化的响应。所有OKT分析均在每个基因型≥6只小鼠上进行。数值为平均值±SEM。n.s.，学生认为不重要t吨测试；*，P（P）<0.05（学生）t吨测试；**，P（P）<0.01（按学生）t吨测试；***，P（P）<0.001（学生）t吨测试。
图3
图3
RBP4-Tg型小鼠存在显性和进行性视网膜内功能障碍，导致继发性光感受器功能障碍。（A和B）1至9个月龄小鼠（野生型）的Scotopic ERG A波和B波振幅。（C） 1-9月龄小鼠的视觉ERG b波振幅。值为每个年龄-基因型组合≥6只小鼠的平均值±SEM。n.s.，通过与Tukey’s的单向方差分析（ANOVA），不显著事后（post-hoc）测试；*，P（P）Tukey's单因素方差分析<0.05事后（post-hoc）测试；**，P（P）Tukey’s单因素方差分析<0.01事后（post-hoc）测试；***，P（P）<0.001，通过Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试。（D） 典型的暗视ERG对光强度增加（0.004至40 cd·s/m）的反应2)在6个月大的小鼠中。注意，与更细微的a波衰减相比，b波明显下降。
图4
图4
RBP4-Tg型小鼠有年龄依赖性的视网膜内变性。（A和B）对1个月（A）或6个月（B）龄小鼠（WT，野生型；ONH，视神经头）视网膜的总视网膜、INL和ONL厚度进行定量组织学分析。值为每个数据点≥8只小鼠的平均值±SEM。*，P（P）与Tukey’s进行单因素方差分析（ANOVA），结果<0.05事后（post-hoc）测试；**，P（P）Tukey’s单因素方差分析<0.01事后（post-hoc）测试；***，P（P）<0.001，通过Tukey的单向方差分析事后（post-hoc）测试。（C至E）来自9个月大小鼠的视网膜石蜡切片的代表性共聚焦图像，用免疫荧光标记视紫红质（C）、视锥S视蛋白（D）、视锥M视蛋白（E）。（F） 6个月龄小鼠视网膜冷冻切片的典型共焦图像，免疫荧光标记为锥体抑制素。DAPI复染显示为蓝色。共聚焦图像是在63倍放大物镜下获得的，但视紫红质图像是在额外的数字变焦2倍下显示的。显示的所有图像均表示z平面采集的最大堆栈。所有图像均取自视网膜中央切片，代表了每种基因型小鼠4至6个独立样本的图像。棒材，10微米（C至E）和20微米（F）。
图5
图5
RBP4-Tg型小鼠的视网膜视觉周期类视黄醇和双视黄醇A2E和iso-A2E水平正常。（A至C）基于高效液相色谱法对安乐死前16小时适应黑暗环境的2至11个月大的小鼠眼睛中的视觉周期维甲酸异构体进行定量。值为每个基因型-年龄组合4只小鼠的平均值±SEM。ns，不显著。P（P）值由Student的t吨测试。（D） 基于HPLC的双维A酸A2E和iso-A2E在周期性室内光照下饲养的9个月大小鼠的眼镜中的定量。值是每个基因型4个样本（总共8只小鼠的每个样本4个眼罩）的平均值±SEM；n.s.，学生认为不重要t吨测试。（E） 采用定量RT-PCR检测3个月龄小鼠视网膜RARβmRNA水平。值为每组3个样品的平均值±SEM。ns，学生认为不重要t吨测试。
图6
图6
RBP4-Tg型小鼠视网膜分层、RPE色素沉着和完整性正常。（A） 野生型（WT）和RBP4总重量6个月龄的小鼠。（B） 苏木精和曙红染色的6个月龄小鼠视网膜切片。放大倍数，×40；棒材，20μm。（C） 6个月大的小鼠视网膜整体底座的亮场图像显示正常RPE色素沉着。放大倍数，×4。（D） 6个月大的小鼠RPE整体的典型共聚焦图像，免疫荧光标记ZO-1以划分紧密连接。共聚焦图像是在63倍放大物镜下采集的，代表z平面采集的最大叠加。棒材，20μm。面板B和D中的图像来自视网膜中央切片。所有图像均代表每种基因型小鼠的4-6个独立样本。
图7
图7
RBP4-Tg型小鼠的视杆和视锥双极细胞随着年龄增长而减少。（A至G）免疫荧光标记不同INL细胞类型的6个月龄小鼠视网膜冰冻切片的代表性共聚焦图像，如下所示：所有双极细胞（绿色，Chx10）和杆双极细胞，钙结合无长突细胞和神经节细胞（钙视网膜蛋白）（D）、甘氨酸无长突电池（GLYT1）（E）、水平电池（钙结合蛋白）（F）和Müller细胞（谷氨酰胺合成酶[GS]）（G）。（H） 视网膜整体的典型共焦图像用NeuN（绿色）免疫标记以染色视网膜神经节细胞体，用β-III微管蛋白（红色）染色神经节轴突。在每个面板中，左侧的图像来自野生型小鼠视网膜，右侧的图像来自RBP4-Tg型小鼠视网膜。共聚焦图像是在63倍（a至G）或40倍（H）放大物镜下获得的，但分泌促进剂（C）和钙结合蛋白（F）图像是用额外的数字变焦×2显示的。显示的所有图像均表示z平面采集的最大堆栈。所有图像都是从视网膜中央切片获得的，并且代表了来自每个基因型小鼠的3-7个独立样本的图像。棒材，10μm。
图8
图8
RBP4-Tg型小鼠在光感受器带状突触和锥体双极终端方面存在缺陷。（A至E）1月龄（A）或6月龄（B至E）小鼠（WT，野生型）视网膜冰冻切片的代表性共焦图像，免疫标记突触前光感受器带状突触（红色，巴松管；绿色，肋眼）（A和B），光感受者带状突触与突触后杆双极细胞树突的连接（红色，巴松管；绿，PKC-α）（C），光感受器带状突触与突触后水平细胞树突（红色，巴松管；绿色，钙结合蛋白）（D）、光感受者突触前终末（红色，VLGUT1）和锥体双极轴突和树突终末（绿色，ZNP-1）（E）的连接。共聚焦图像是在63倍放大物镜下采集的，但面板a至C显示的是额外的数字变焦×4，面板D显示的是附加的变焦×6。显示的所有图像均表示z平面采集的最大堆栈。DAPI埋头孔显示为蓝色。箭头，替换VGLUT1；箭头，ZNP-1标签变薄或丢失。所有图像均取自视网膜中央切片，代表了每种基因型小鼠4至8个独立样本的图像。棒材，10μm。
图9
图9
RBP4-Tg型小鼠视网膜血管系统正常。（A） 野生型（WT）和RBP4-Tg型6个月龄的小鼠。显示的每个图像都来自不同的鼠标。（B） 在视网膜白细胞抑制术后，用FITC-伴刀豆球蛋白a灌注小鼠以标记粘附的白细胞，从整个视网膜获得的荧光图像。箭头，粘附的白细胞。放大倍数，×20。（C） 视网膜白细胞沉积定量。值为每个基因型-年龄组合≥3只小鼠（6只眼睛）的平均值±SEM。通过双向方差分析，基因型之间没有统计学上的显著差异。
图10
图10
RBP4-Tg型小鼠出现早期视网膜胶质增生和小胶质细胞活化。（A和B）1个月龄小鼠（A）和6个月龄鼠（B）视网膜冷冻切片的代表性共焦图像，免疫荧光标记GFAP，一种胶质增生症标记物（WT，野生型）。DAPI埋头孔显示为蓝色。共聚焦图像是在40倍放大物镜下采集的，代表z平面采集的最大叠加。所有图像均取自视网膜中央切片，代表了每种基因型小鼠的3-5个独立样本的图像。棒材，10μm。（C和D）1个月龄小鼠视网膜整体镶嵌物的典型共焦图像，免疫荧光标记小胶质细胞标记物CD11b。共聚焦图像是在40倍放大物镜下采集的，每个图像代表一层z平面采集。箭头所示，小胶质细胞具有激活的小胶质细胞特征的细胞体扩大。所有图像都是从中周采集的，代表了每种基因型小鼠3到6个独立样本的图像。棒材，40μm。（E和F）在40倍放大物镜下对视网膜整体支架中的小胶质细胞体进行计数。每个视场对应于0.14毫米的表面积2每个基因型的视网膜中有3-5个小胶质细胞。数值为平均值±SEM。**，P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图11
图11
小胶质细胞投射延伸至外核层RBP4-Tg型老鼠。（A和B）免疫荧光标记小胶质细胞标记物Iba-1的6个月龄小鼠视网膜整体支架的典型共焦图像。共聚焦图像是在63倍放大物镜下获得的，每个图像代表内丛层（GCL，神经节细胞层）的z系列。数字框表示以较高放大倍数显示在原始图像右侧的单元格。所有图像都是从中周采集的，代表了每种基因型小鼠3到5个独立样本的图像。注意小胶质细胞中增大的细胞体RBP4-Tg型小鼠视网膜。棒材，40μm。（C和D）免疫荧光标记CD31（红色）和Iba-1（绿色）或CD11b（绿色）（D）的6个月龄小鼠视网膜整体支架的代表性3D共聚焦图像。所有图像都是从中周采集的，代表了每种基因型小鼠3到5个独立样本的图像。注意视网膜中小胶质细胞延伸至ONLRBP4-Tg型仅限老鼠。
图12
图12
RBP4-Tg型小鼠有视网膜神经炎症。qRT-PCR分析显示，6个月龄RBP4-Tg小鼠视网膜中pro-IL-18（A）mRNA表达水平升高，pro-IL-1β（B）mRNA的表达水平降低。（C） Western blot显示视网膜中成熟IL-1β的表达RBP4总重量或3个月大的野生型小鼠。Lane+C，1μg重组小鼠IL-1β作为阳性对照。45kDa附近的上带为β-actin，15kDa左右的下带为成熟IL-1β。（D和E）Western blot和密度测定（densitometer）分析显示，成熟IL-18在视网膜中的表达显著增加RBP4-Tg型6个月大的小鼠。密度测定来自3个独立实验，每个基因型3只小鼠。（F） ELISA法测定血清IL-18水平。（G） 通过与比色底物YVAD-pNA孵育，测定6月龄小鼠视网膜裂解物中caspase-1的酶活性。（H） qRT-PCR分析显示6个月大的大鼠视网膜中NLRP3 mRNA表达水平下降RBP4-Tg型老鼠。每个基因型4至6只小鼠的数值为平均值±SEM。n.s.，学生认为不重要t吨测试；*，P（P）<0.05（学生）t吨测试；**，P（P）<0.01学生t吨测试；***，P（P）<0.001（学生）t吨测试。
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