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.2015年6月5日;10(6):e0128416。
doi:10.1371/journal.pone.0128416。 电子收集2015。

感觉启动子相关RNA在双向转录长控制区调控人乳头瘤病毒18的基因沉默和激活

附属公司

人类乳头瘤病毒18的基因沉默和激活受双向转录长对照区正义启动子相关RNA的调节

穆扎弗·艾哈迈德·卡斯布等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景:最近,各种研究表明启动子相关非编码RNA(pRNA)在dsRNA诱导的转录基因沉默和激活中的作用。然而,关于pRNAs定向的这些过程的确切机制细节尚不明确。

方法/主要发现:我们在HPV18阳性宫颈癌细胞系HeLa、C-4I和C-4II中发现了新的正反义长控制区相关RNA(pRNAs)。使用dsRNAs对抗这些pRNAs,我们能够实现正、反义pRNA以及下游E6和E7癌基因的上调或下调。我们提供的证据表明,正义pRNA的敲除与E6和E7癌基因的减少和反义pRNA的上调有关。相反,正义pRNA的上调伴随着癌基因的诱导和反义mRNA的伴随减少。此外,正义和反义pRNA在dsRNA介导的基因调节中的确切作用通过使用反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(ODN)的选择性降解得到证实。用反义ODN降解有义pRNA导致失去dsRNA诱导的沉默和激活,这表明dsRNA介导的基因调控需要有义pRNA.这两个过程都伴随着激活组蛋白和抑制组蛋白甲基化模式的一致变化。

结论/意义:因此,该数据确定并证明了之前未知的重要调节转录物在HPV18基因表达中的作用,这可以证明在宫颈癌治疗中有价值的靶点。这种双向转录的基因调控模式也可以在其他启动子中操作,并作为调节基因表达的机制。

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竞争利益:提交人声明,不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。HPV18阳性细胞系LCR处pRNA的检测。
(A) HPV18 LCR的示意图,显示四个LCR特异性引物的位置。还描述了侧翼基因和转录起始位点(TSS)。为了检测LCR中的pRNA,从HeLa、C-4I和C4-II细胞中分离出RNA,并使用四组LCR特异性重叠引物P1、P2、P3和P4进行RT-PCR。(B) 凝胶图显示pRNA在HeLa LCR中的分布。在LCR(C)的所有区域发现的pRNA在C-4I LCR中存在。pRNA仅在P2区检测到。(D) 在C-4 II LCR中存在pRNA。在LCR的P2和P4区域检测到pRNA。P1代表P1rev:使用P1F和P1R引物进行PCR,P2代表P2rev:用P2F和P2R引物执行PCR,P3代表P3rev:采用P3F和P3R引物完成PCR,P4代表P4rev:利用P4F和P4R引物开展PCR。HeLa cDNA:作为阳性PCR对照,NRT:阴性RT,NTC:无模板对照,M:100bp梯形图。
图2
图2。HPV18整合HeLa细胞pRNA定向的测定。
对从细胞中提取的RNA进行DNA酶处理,并使用pRNA特异性正向(反义特异)或反向(义特异)引物进行逆转录,同时使用正向和反向引物进行PCR。P1F:用P1F引物进行RT,用P1F和P1R引物进行PCR,P1R:用P1R引子进行RT,再用P1F和P1R引物PCR,P2F:用P2F引物RT,再用P2F和P2R引物PCR,P2R:用P2R引子RT,用P2F和P2R引物PCR,P3F:用P3F引物CR,用P3F和P3R引物的PCR,P3R:用P3R引物进行RT,用P3F和P3R引子进行PCR,P4F:用P4F引物进行RT-PCR,用P4F和P4R引物做PCR,P4R:用P4R引文进行RT,再用P4F和P2R引物作PCR,NRT:阴性RT,NTC:无模板对照,M:100bp梯形图。
图3
图3。正、反义pRNA延伸至整个LCR和HeLa细胞的侧翼基因。
(A) 反义pRNA:使用P1F引物(反义pRNA-特异性)逆转录RNA。使用不同的引物组合,即P1F和P4R、P2F和P4R、P3F和P4R-、P4F和P4R.对形成的cDNA进行PCR扩增。(B) 有义pRNA:P1R引物(有义pRNA-特异性)用于逆转录RNA,并使用指示的引物即P1F和P1R、P1F和P2R、P1F和P3R、P1F和P4R扩增形成的cDNA。(C) Sense pRNA延伸到E6和E7编码区。P1F引物用于HeLa RNA的反转录,形成的cDNA用不同引物PCR扩增,如图所示,P4F/E6R:PCR用P4正向和E6反向引物,P4F/E7R:PCR带P4正向及E7反向引物(D)反义pRNA延伸到L1编码区。用P4R引物逆转录HeLa RNA,形成的cDNA用不同的引物进行PCR扩增,L1F/P1R:PCR用L1正向和P1反向引物,L1F/P2RN:PCR用L2正向和P2RN引物,NRT:阴性RT,NTC:无模板对照,M:100bp梯形。
图4
图4。筛选靶向HPV18 pRNAs的dsRNAs。
(A) HPV18 LCR的示意图和不同dsRNA靶位点的位置。(B) 用7个dsRNAs(100nM)转染C-4 II细胞。C) 用S1和S5 dsRNA转染HeLa细胞(D)C-4I细胞中的S1和S-5 dsRNA。用各自的dsRNA转染细胞,转染72小时后分离RNA,并通过实时RT-PCR进行分析。通过REST软件计算18S rRNA、POLR2A、PPIA和β-actin的表达率,并将其归一化为对照dsRNA。E6:dsRNA转染后E6癌基因的表达。E7:dsRNA转染后E7癌基因的表达。Control-dsRNA:对照dsRNA转染细胞,(*)P<0.05。
图5
图5。HeLa细胞中pRNA的表达。
用S1或S5 dsRNA(100nM)转染细胞,并在转染72小时后分析pRNA表达。使用pRNA特异性引物进行实时PCR分析。S1和S5转染显示pRNA表达显著降低(p<0.01)。通过REST软件计算18S、POLR2A、PPIA和β-肌动蛋白的表达率。pRNA:靶向S1或S5 dsRNA转染细胞的pRNA。Control-dsRNA:控制dsRNA处理的细胞。
图6
图6。S1或S5 dsRNA转染后HeLa中双向pRNA转录的变化。
用P2引物定向qRT-PCR检测正、反义pRNAs水平。以18S为内对照,采用delta-delta-Ct方法计算正、反义pRNA表达的折叠变化。对照组:对照dsRNA处理的细胞,S1P2F:转染S1 dsRNA的细胞,然后用P2F引物进行RNA分离和反转录,S1P2R:转染了S1 dsRNA和分离出的RNA的细胞用P2R引物进行反转录,S5P2F:转染了S5 dsRNA和分离出RNA的细胞使用P2F引子进行反转录,S5P2R:用P2R引物逆转录S5 dsRNA转染细胞和分离的RNA。
图7
图7。pRNA介导的基因激活。
(A) HeLa细胞中HPV18 pRNA中靶向非CpG位点的三种dsRNA(100nM)的筛选。转染72小时后,通过实时PCR分析转染细胞的RNA。通过REST软件计算18S、POLR2A、PPIA和β-actin的表达率。S8-dsRNA:S8 dsRNA转染细胞,S9-dsRNA:S9 dsRNA转播细胞,S10-dsRNA:10 dsRNA转导细胞。对照:对照dsRNA转染细胞。(*)P<0.01,(**)P=0.03。(B) S9 dsRNA转染后双向转录的变化。通过用S9 dsRNA转染Hela细胞,然后在转染72小时后分离RNA,检测正、反义pRNA的水平。然后使用P2引物通过实时PCR对cDNA进行分析。P2F:转染S9 dsRNA的细胞,然后进行RNA分离,并用P2F引物逆转录反义pRNA,P2R:转染了S9 dsRNA的细胞,随后进行RNA分离并用P2R引物逆序转录反义mRNA。使用归一化为对照dsRNA处理样品的delta-delta-Ct方法计算18S rRNA的表达率。
图8
图8。dsRNA转染后的表观遗传修饰。
(A) S1、S5或S9 dsRNA转染后的染色质重塑。S1和S5转染72小时后MNase消化显著减少,而S9转染HeLa细胞后可获得性增加。在转染72小时后,用相应的dsRNAs转染细胞,然后进行MNase-PCR。S1:S1 dsRNA转染细胞,S5-dsRNA:S5 dsRNA转导细胞,S9-dsRNA:S9 dsRNA转播细胞,Control-dsRNA:对照dsRNA转送细胞(*)P<0.01。Bi-Biv。在dsRNA靶位点富集H3K9me2、H3K27me3和H3K4me2。dsRNA诱导的TGS与H3K9me2和H3K27me3的增加有关,而TGA与H3K4me2的增加有关。用各自的dsRNA转染HeLa细胞,72小时后用所需抗体进行ChIP分析,以提取目标DNA。用区域特异性引物对沉淀的DNA进行PCR分析。在没有抗体(小鼠IgG)的情况下被拉下的DNA用于鉴定背景扩增,而输入DNA被扩增作为负载对照。(Bi)凝胶电泳图显示在S1和S5 dsRNA转染细胞中ChIP后获得的PCR产物。(Biii)凝胶电泳图,显示在S9 dsRNA转染细胞中ChIP后获得的PCR产物。(Bii和Biv)用ImageJ软件对A和B中显示的ChIP数据进行密度分析。相对富集度=ChIP/输入DNA。1:H3K9me2免疫沉淀PCR,2 and I:H3K27me3免疫沉淀PCR。第二章。HDAC抑制对TGS和TGA的影响。S1、S5或S9转染后pRNA、E6和E7的表达率。用dsRNA(100nM)转染HeLa细胞,24小时后用DMSO或TSA(400nM)处理,48小时后分离RNA。(Ci)dsRNA转染细胞中的TSA治疗。(Cii)二甲基亚砜(TSA和AZA溶剂)处理dsRNA转染细胞。
图9
图9。基因表达对pRNA转录的要求。
(A) ODN靶向的特异性:检查ODN是否调节HeLa中的双向转录。用各自的ODN处理HeLa细胞,然后使用带有P2引物的定向qRT-PCR分析pRNA表达。SEN P2F:转染正义ODN和P2正向引物(反义pRNA特异)的HeLa细胞用于定向RT-PCR SEN P2R:转染义ODN和P2反向引物(正义pRNA特异性)的HeLa细胞用于定向RT-PCR,ANT P2F:反义ODN与P2正向引物(反义pRNA特异用于定向RT-PCR,ANT P2R:转染有正义ODN和P2反向引物(正义pRNA特异)的HeLa细胞,用于定向RT-PCR Control-ODN:对照ODN处理的细胞。通过REST软件计算18S rRNA的表达率,并将其归一化为对照dsRNA处理样品。(B) 正反义pRNA敲除对ODN在HeLa中表达pRNA、E6和E7的影响。对照ODN:对照ODN转染的细胞,SEN-ODN:有义ODN转染的细胞,ANT-ODN:反义ODN转染的细胞。(*)P<0.01,(**)P<0.05。C: 感官pRNA降解介导异染色变。反义ODN转染72小时后,MNase消化显著减少,而对照或感观ODN转导对HeLa细胞无影响。Control-ODN:对照ODN转染细胞,SEN-ODN:转染有义ODN的细胞,ANT-ODN:反义ODN转导的细胞,(*)P<0.05。
图10
图10。正、反义pRNA下调对dsRNA介导的TGS和TGA的影响。
用正反义ODN转染HeLa细胞,24小时后转染相应的dsRNA。从细胞中分离出RNA,并通过实时PCR进行分析。通过REST软件计算18S、POLR2A、PPIA和β-actin的表达率。(A) 反义ODN转染Hela细胞。(B) 转染正义ODN的HeLa细胞。Control-dsRNA:对照dsRNA转染的细胞,S1-dsRNA:S1-dsRNA转染细胞,S5-dsRNA:S5 dsRNA转播细胞,S9-dsRNA:S9 dsRNA转导细胞。

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