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.2015年9月1日；24(17):4829-47.
doi:10.1093/hmg/ddv207。 Epub 2015年6月3日。

抑制细胞溶质翻译和自噬可改善线粒体疾病患者的健康状况

闵鹏 1, 朱利安·奥斯特罗夫斯基 2, 杨俊权 2, Erzsebet Polyak公司 2, 约瑟夫·利卡塔 2, 筑川美 2, 埃里克·玛尔蒂 2, 杰弗里·托马斯 三, 卡罗琳·菲利克斯 4, 芮晓 5, 张哲 6, 大卫·L·加斯尔 7, Yair Argon公司 三, 马尔尼·J·福尔克 8
附属公司

抑制细胞溶质翻译和自噬可改善线粒体疾病患者的健康状况

闵鹏等。 人类分子遗传学. .

摘要

针对线粒体内病理学的线粒体呼吸链疾病治疗大多无效。认识到RC功能障碍会引起明显的胞外转录适应，尤其是涉及翻译失调的转录适应，我们假设翻译失调本身也有助于RC疾病的病理生理学。在这里，我们研究了一种中心翻译调节因子（mTORC1）及其下游生物过程在RC疾病的不同遗传和药理模型中的活性和直接抑制的作用。我们的数据确定了RC功能障碍细胞发病机制的新机制，包括蛋白毒性应激、内质网应激反应和自噬的联合诱导。雷帕霉素对mTORC1的抑制可部分改善具有复合物I-III/II-III缺陷的B6.Pdss2（kd/kd）小鼠的肾脏疾病，提高具有复合物I缺陷的gas-1（fc21）线虫的存活率和线粒体生理学，并挽救各种RC-抑制人类细胞的存活率。更有效的是普罗布考，一种PPAR激活的抗脂质药物，我们发现它也能抑制mTORC1。然而，直接抑制mTORC1调节的下游活动产生了最显著和持续的益处。环己酰亚胺部分抑制翻译或氯化锂部分抑制自噬，可挽救生存能力，保持细胞呼吸能力，并诱导线粒体翻译和生物生成。环己酰亚胺还通过独特的选择性减少胞浆蛋白翻译来改善蛋白质毒性应激。基于RNAseq的转录组分析对gas-1（fc21）突变体的治疗效果提供了进一步证据，证明这些治疗有效地恢复了野生型动物改变的翻译和自噬途径。总的来说，部分抑制细胞溶质翻译和自噬提供了新的治疗策略，以改善各种人类疾病（其发病机制涉及RC功能障碍）的健康状况。

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数字

图1。
图1。
B6中mTORC1活性增加。第2页千卡/千卡小鼠肾脏和基于遗传或药理学的RC疾病的人类细胞模型中，并通过普罗布考或雷帕霉素治疗逆转。pS6的表达通过western blot分析测定，各组间的相对表达变化在ImageJ中量化。(A类)在出生40或120天时，对野生型（B6）和B6的肾脏进行pS6蛋白印迹分析。第2页千卡/千卡（“kd”）小鼠。图像J中计算的相对定量显示在每个波段的下方。(B类)通过B6的pS6蛋白印迹分析研究肾脏。第2页千卡/千卡与未经治疗的B6相比，用普罗布考治疗从断奶到50岁的小鼠。第2页千卡/千卡室友。(C类)120日龄B6的肝脏。第2页千卡/千卡突变小鼠从断奶开始喂食正常的食物或普罗布考。(天)第2页在不同营养条件下生长的人足细胞中被siRNA击倒。第2页将siRNA和对照人足细胞在33°C的温度下培养24 h，培养基为10%的FBS、RPMI-1640，其中含有高糖（25 m）米)，半乳糖（10 m米)或者不加糖。(E类)普罗布考对不同营养条件下健康人足细胞的影响。使用或不使用100µ米普罗布考在含有25 m的RPMI培养基中过夜米33°C下葡萄糖或无葡萄糖4或24小时(F类)雷帕霉素在不同营养条件下处理健康人足细胞。人足细胞在有或无20 n的培养基中培养米雷帕霉素在33°C的RPMI培养基中放置24小时米葡萄糖或无葡萄糖培养基。(G公司)来自患有FBXL4型-基于原发性RC疾病。人成纤维细胞在37°C下在10%FBS、DMEM和5 m培养基中培养24 h米来自健康对照受试者或线粒体疾病患者的葡萄糖培养基，其原发性（遗传性）RC复合物I和III缺陷是由复合杂合子突变引起的FBXL4型(21). pS6和总S6蛋白的相对定量显示在每个条带下方，如在ImageJ中计算的。
图2。
图2。
在RC疾病的动物和细胞模型中，mTORC1活性失调的药理学逆转与显著的健康益处相关。(A类)普罗布考或雷帕霉素治疗可缓解B6患者的肾小球疾病。第2页千卡/千卡突变小鼠。野生型B6的20小时尿白蛋白水平（mg）(n个=26），未经处理的B6。第2页千卡/千卡突变体(n个=44）和CoQ10(n个=10，饮用水中为1 mg/ml），普罗布考(n个=25，1%w/w饮食），雷帕霉素(n个=7225 PPM饮食）或辅酶Q10（饮用水中1 mg/ml）加雷帕霉素(n个=11）供给B6。第2页千卡/千卡小鼠在～140天大时从断奶到牺牲。(B类和C类)缩短的使用寿命气体1（fc21)复合物I突变体秀丽线虫用（B）普罗布考（5µ米)或（C）雷帕霉素（2.5 n时效果最佳米（显示）和25 n米中位寿命和最大寿命）。n个，每个条件下研究的动物数量。乙醇被用作两种药物的缓冲对照。两种药物的全面统计分析和额外治疗剂量试验见补充材料，表S1. (天)雷帕霉素可维持人足细胞的细胞活力，尽管鱼藤酮可直接抑制RC。人足细胞在33°C下在RPMI-1640中培养48小时，培养时间为11 m米葡萄糖、10%FBS和RC复合物I抑制剂鱼藤酮（25 n米或50 n米)单独或与50 n米雷帕霉素。n个=每种情况3*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。
图3。
图3。
环己酰亚胺直接抑制细胞溶质翻译可保持RC缺陷细胞的活力。(A类)鱼藤酮在人足细胞中的剂量范围。健康人足细胞在33°C的RPMI-1640中培养48小时，11米米在葡萄糖和10%的FBS培养基中加入浓度增加的强效RC复合物I抑制剂鱼藤酮（12.5、25、50、100 n）米)单独使用或使用3.6µ米环己酰亚胺（CHX）。n个=每种情况3。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。(B类)尽管RC受到直接抑制，但随着时间的推移，对细胞溶质翻译的逐步有效抑制仍能保持细胞活力。健康人足细胞在33°C的RPMI-1640中培养6天，11 m米葡萄糖和10%FBS培养基用50n处理米鱼藤酮（ROT）单独或与1.8µ米环己酰亚胺（CHX），1.8µ米茴香霉素（ASM）或40 n米放线菌素（ATM）。n个=每种情况3。形状和误差条分别表示平均值和标准偏差。统计显著性由Student’st吨-测试，其中P（P）在第1天和P（P）与对照组相比，其他所有治疗日的罗藤酮均<0.001。放线菌酮加鱼藤酮的存活率与未经处理的对照组在任何一天的存活率没有显著差异。相对于对照，对于樟柳霉素加鱼藤酮，P（P）第1天和第2天<0.01P（P）其他所有日期<0.001；放线菌素加鱼藤酮相对于对照，P（P）第3天<0.01P（P）其他所有日期<0.001。相对于鱼藤酮处理的细胞，药物治疗显著恢复了环己酰亚胺的活性(P（P）在第1天和P（P）<0.001（所有其他天），茴香霉素(P（P）第1天<0.01P（P）<0.001）或放线菌素(P（P）第1天<0.05P（P）<0.001）。(C类)环己酰亚胺在鱼藤酮处理的人成纤维细胞中保持活性。健康人成纤维细胞（FCL-F35）在37°C的DMEM中培养6天，5.6米米葡萄糖和10%FBS培养基用100n处理米鱼藤酮（ROT）单独或与1.8µ米环己酰亚胺（CHX）。n个=每种情况3。形状和误差条分别表示平均值和标准偏差。统计显著性由Student’st吨-测试。相对于对照，鱼藤酮，P（P）第3天和第4天<0.01P（P）第5天和第6天<0.001；鱼藤酮和环己酰亚胺相对于对照，P（P）第5天和第6天<0.01；对于鱼藤酮和环己酰亚胺，相对于单独鱼藤酮，P（P）第3天<0.01P（P）在第4天、第5天和第6天<0.001。(天)环己酰亚胺在鱼藤酮处理的HeLa细胞中保持活性。HeLa细胞在37°C的DMEM中培养6天，5.6 m米葡萄糖和10%FBS培养基用125n米鱼藤酮（ROT）单独或与1.8µ米环己酰亚胺（CHX）。n个=每种情况3。形状和误差条分别表示平均值和标准偏差。统计显著性由Student’st吨-试验，其中鱼藤酮相对于对照，P（P）第2天至第6天均<0.001；鱼藤酮和环己酰亚胺相对于对照，P（P）第6天<0.05，鱼藤酮加环己酰亚胺相对于鱼藤酮单独使用，P（P）从第2天到第6天，<0.001。(E类)环己酰亚胺或普罗布考治疗可防止半乳糖培养基中鱼藤酮诱导的细胞死亡。健康人足细胞暴露于12.5 n米鱼藤酮（ROT）在10 m内24小时米含或不含1.8µ的半乳糖（无葡萄糖）培养基米环己酰亚胺（CHX）或100µ米普罗布考。n个=每种情况3。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。(F类)环己酰亚胺和普罗布考需要联合治疗，以防止半乳糖培养基中细胞因鱼藤酮和氧化应激的加性效应而死亡。健康人足细胞暴露于12.5n米鱼藤酮（ROT）和/或100µ米过氧化氢（H2O（运行）2)在10 m内持续48小时米含或不含1.8µ半乳糖（无葡萄糖）无血清培养基米环己酰亚胺（CHX）和/或100µ米普罗布考。n个=每种情况3。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差**P（P）<0.01和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。
图4。
图4。
环己酰亚胺以营养依赖但不依赖于RC复合位点的方式，部分选择性地抑制转化，以直接抑制RC来拯救细胞活力和总细胞呼吸能力。(A类)鱼藤酮对细胞溶质/ER蛋白合成速率无影响，但环己酰亚胺可部分降低其合成速率。实心黑线表示控制蛋白质合成速率。用3.6或50µ的环己酰亚胺（CHX）处理人成纤维细胞24小时米单独或与100 n的浓度米鱼藤酮（ROT）***P（P）<0.001（学生）t吨-与非治疗对照组相关的试验。(B类)环己酰亚胺对细胞溶质翻译有选择性作用。用50 n或50 n处理人足细胞米鱼藤酮单独或与3.6µ米CHX用于指示的时间段，然后用标签标记40分钟35S-Cys/Met.公司。测定每个细胞裂解物的TCA可沉淀计数。用SDS–PAGE分析含有约等量合并放射性的部分裂解物。荧光法检测蛋白质条带。箭头，蛋白质带，其强度随着CHX的添加而增加（开放箭头）或减少（填充箭头），与鱼藤酮单独处理相比。(C类)尽管RC受到抑制，环己酰亚胺仍能保持细胞形态。健康人足细胞在RPMI-1640、10%FBS和11 m培养基中培养48 h米仅葡萄糖培养基（左面板），含50 n米鱼藤酮（中央面板）或50n米鱼藤酮和1.8µ米环己酰亚胺（右侧面板）。(天)放线菌酮通过延长RC抑制来维持细胞活力是营养依赖性的。人类足细胞在33°C下处理6天，50 n米鱼藤酮（ROT）抑制DMEM、10%FBS和1.8µ米具有系列浓度葡萄糖（11 m）的环己酰亚胺（CHX）米，5.6米米，2.8米米，无葡萄糖）。n个=每种情况3。形状和误差条分别表示平均值和标准偏差。Student’s测定了鱼藤酮和环己酰亚胺的每种葡萄糖浓度相对于鱼藤酮的统计显著性t吨-测试。对于两个11 m米葡萄糖和5.6米米葡萄糖P（P）第1天<0.01P（P）第2-6天<0.001；2.8米米葡萄糖P（P）第1天和第3天<0.05P（P）第2天<0.001；在无葡萄糖的情况下P（P）<0.05仅在第1天。(E类)环己酰亚胺维持细胞活性与抑制RC复合位点无关。人足细胞在33°C的RPMI-1640中培养48小时，11 m米葡萄糖，10%FBS培养基单独或用50 n处理米鱼藤酮（复合I抑制剂），50 n米抗霉素A（复合III抑制剂）或100 n米寡霉素（复合V抑制剂），含或不含3.6µ米环己酰亚胺（CHX）。n个=每种情况3。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差***P（P）相对于对照或相对于同一抑制剂加环己酰亚胺，每种抑制剂均<0.001，Student’st吨-测试。(F类)尽管RC复合物I受到直接抑制，但环己酰亚胺仍能保持细胞的呼吸能力。对11 m的健康人足细胞进行了高分辨率呼吸测定（氧饱和度仪2K，Oroboros）米葡萄糖培养基单独或暴露于50n 24小时米鱼藤酮（ROT）和/或1.8µ米环己酰亚胺（CHX）。测量的呼吸状态包括常规（基础）、泄漏（非线粒体）和最大（ETS、电子传输系统）。n个=每个条件3个。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差**P（P）<0.01和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。
图5。
图5。
线粒体功能障碍中细胞死亡的机制研究。(A类)环己酰胺可防止鱼藤酮诱导的自噬。Western blot分析在10%FBS，RPMI，11m培养的健康人足细胞中的自噬（p62，LC3BI/II，pGSK3β）和凋亡（PARP，CASP3）激活标记物米50n葡萄糖培养基米鱼藤酮和/或1.8µ米环己酰亚胺（CHX）在33°C下放置16、24或48小时。从三个具有相同结果的生物复制实验中显示出代表性印迹。(B类)在直接RC抑制中抑制自噬介导的线粒体降解可保持细胞活力。人类足细胞暴露于50 n米500µ鱼藤酮米3-甲基腺嘌呤（3-MA）单独或与20µ米ZVAD和/或50µ米坏死抑制素在33°C下放置16、24和48小时。n个=每种情况3。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差**P（P）<0.01和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。横条正上方的星号表示相对于对照的显著性，而横线上方的星点表示特定组比较的显著性。(C类)直接RC抑制中细胞翻译和线粒体降解的下调最大限度地保持了细胞活力。人足细胞在10%FBS、RPMI、11 m米葡萄糖，暴露48小时至50 n米鱼藤酮单独或与500µ米3-MA，20米米氯化锂（LiCl）和/或50 n米雷帕霉素。n个=每种情况3。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。条形正上方的星号表示相对于对照的显著性，而水平线上方的星号表示特定组比较的显著性。(天)在直接复合物I抑制中通过氯化锂治疗抑制自噬保持细胞总呼吸容量。对11 m的健康人足细胞进行了高分辨率呼吸测定（氧饱和度仪2K，Oroboros）米葡萄糖培养基暴露24h至50n米鱼藤酮（ROT）单独或与20 m米氯化锂。测量的呼吸状态包括常规（基础）、泄漏（非线粒体）和最大（ETS、电子传输系统）。n个=每个条件3个。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差**P（P）<0.01（按学生）t吨-测试。
图6。
图6。
环己酰亚胺治疗RC-抑制细胞可诱导线粒体翻译，拯救细胞ATP水平，并需要完整的蛋白酶体和糖基化能力。(A类)氯霉素部分逆转环己酰亚胺对RC复合物I抑制足细胞总细胞呼吸能力的保护作用。对11 m的健康人足细胞进行了高分辨率呼吸测定（氧饱和度仪2K，Oroboros）米葡萄糖培养基暴露24小时至50n米鱼藤酮（ROT）和/或1.8µ米含或不含50µ的环己酰亚胺（CHX）米氯霉素（CAP）。测量的呼吸状态包括常规（基础）、泄漏（非线粒体）和最大（ETS、电子传输系统）。n个=每种情况3。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差。#P（P）< 0.1; *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。横条正上方的星号表示相对于对照的显著性，而横线上方的星点表示特定组比较的显著性。(B类)环己酰亚胺可拯救经鱼藤酮处理的人足细胞的细胞活力。人类足细胞单独或联合暴露于50µ米氯霉素（CAP），35 n米鱼藤酮（ROT），1.8µ米CHX，25牛顿米雷帕霉素（RAPA）或20 m米氯化锂（LiCl）在11m内保持48小时米葡萄糖。n个=每种情况3*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。横条正上方的星号表示相对于对照的显著性，而横线上方的星点表示特定组比较的显著性。(C类)环己酰亚胺对遗传性RC疾病细胞活力的保护需要完整的蛋白酶体活性。控制或FBXL4型-突变的人成纤维细胞在10米内生长米葡萄糖单独或与5µM MG-132（抑制蛋白酶体活性）和/或0.9µM CHX共同作用72小时。n个=每种情况3。条形图和误差条形图分别表示平均偏差和标准偏差*P（P）<0.05和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。横条正上方的星号表示相对于各自控制条件的显著性，而水平线上方的星标表示特定组比较的显著性。(天)环己酰亚胺在遗传性RC疾病中保护细胞免受内质网应激。控制或FBXL4型-突变人成纤维细胞在10m内生长米葡萄糖单独或与0.5µ米衣霉素（TM，诱导内质网应激）和/或0.9µ米瑞士。n个=每种情况3。条形图和误差条形图分别表示平均值和标准偏差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 和***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。横条正上方的星号表示相对于各自控制条件的显著性，而水平线上方的星点表示特定组比较的显著性。(E类)环己酰亚胺通过在复合物I或V中抑制RC 24小时来防止内质网应激激活。通过western blot分析，在含有10%FBS和5.6 m FBS的DMEM中培养的健康人成纤维细胞中定量GRP78蛋白的表达米葡萄糖24小时，用2µ米衣霉素，200 n米鱼藤酮或100 n米寡霉素单独或与1.8µ米瑞士。(F类)环己酰亚胺通过在复合物I或V中抑制RC 6小时来防止内质网应激的激活。PERK蛋白表达通过western blot分析在含有10%FBS和11m FBS的RPMI中培养的健康人足细胞中定量米葡萄糖6小时，用2µ米衣霉素，200 n米鱼藤酮或200 n米寡霉素单独或与1.8µ米瑞士。
图7。
图7。
环己酰亚胺、普罗布考或雷帕霉素在线粒体复合体I突变成虫中的路径水平RNAseq转录组效应。药物治疗对(A类)显著上调和(B类)KEGG通路显著下调气体1（fc21）相对于N2（野生型）蠕虫。显示了KEGG通路的富集分数，该通路在气体-1（fc21）相对于N2的蠕虫(P（P）<0.05），其中乙醇用作缓冲对照。这些途径的相对影响气体1（fc21）用环己酰亚胺（2.5µ米)普罗布考（5µ米)或雷帕霉素（2.5 n米)也显示，能够评估每种治疗在多大程度上改善了单个KEGG通路中的失调。完整结果见补充材料，图S1、表S1、图S13和S14.
图8。
图8。
线粒体RC功能障碍的一般细胞反应示意图模型和恢复细胞健康的相应治疗方法。蓝色正方形和绿色椭圆形分别表示普通细胞和线粒体。箭头和条形分别表示激活和抑制作用。橙色“P”表示其活性受磷酸化调节的分子。红色字体和箭头表示对细胞信号的主要成分和线粒体功能障碍的单个细胞器反应的直接影响，最终导致蛋白质毒性应激增加。带括号的红色数字突出了钢筋混凝土疾病的影响，我们的实验证据支持这一点，如下所示：（1）补充材料，图S1A、C、F、G、H和I; (2)补充材料，图S1A、D、E、F和G; （3） 图6E和F；（4） 图5A-C；和（5）图7B。紫色字体、箭头和横条分别表示药物的特定部位和一致作用（实线表示直接作用；虚线表示可能的间接作用），这些药物可以在RC功能障碍的情况下恢复细胞生理平衡和细胞活力。带括号的紫色字母突出了个别药物的作用，我们支持的实验证据包括：（a）补充材料，图S1B、D和E; （b） 图1B、C、E；（c） 图4B、7和补充材料，图S5A; 和（d）图5B。RAPA、雷帕霉素。CHX，环己酰亚胺。氯化锂、氯化锂。3-MA，3-甲基腺嘌呤。
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