跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

HTTP服务器

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2015年6月2:5:10682。
doi:10.1038/srep10682。

大麻素受体2激动剂诱导的初级巨噬细胞趋化作用独立于CB2受体发生

附属公司

大麻素受体2激动剂诱导的初级巨噬细胞趋化作用独立于CB2受体发生

刘易斯·泰勒等。 科学代表. .

摘要

CB2的激活已被证明可诱导定向免疫细胞迁移。然而,CB2在巨噬细胞中作为趋化性受体的能力在很大程度上尚不清楚。利用实时趋化性分析和一组化学多样性和广泛使用的CB2激动剂,我们开始研究CB2是否调节小鼠原代巨噬细胞的趋化性。我们报告,在12种受试激动剂中,只有JWH133、HU308、L-759656和L-759633作为巨噬细胞趋化剂。令人惊讶的是,CB2的药物抑制或基因消融对CB2激动剂诱导的巨噬细胞趋化性均无任何影响。由于WT和CB2(-/-)巨噬细胞的趋化性均对百日咳毒素敏感,我们得出结论,非CB1/CB2,Gi/o-偶联GPCR必须负责CB2激动剂诱导的巨噬细胞迁移。明显的候选受体GPR18和GPR55不能介导JWH133或HU308诱导的细胞骨架重排,也不能介导转染这两种受体的细胞中JWH133-诱导的β-抑制素募集,这表明这两种未知的GPCR都不是。综上所述,我们的结果最终证明了CB2不是小鼠巨噬细胞的化学吸引受体。此外,我们首次表明JWH133、HU308、L-759656和L-759633在原代细胞中具有功能性后果的非靶向效应,我们认为我们的发现对整个大麻素领域具有广泛的意义。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。CB2选择性激动剂JWH133、HU308和DIAS2诱导小鼠PEC定向迁移的能力不同。
(A类)将生物凝胶诱导的小鼠PEC放置在改良的96孔Boyden室(8μm孔径),并允许向载体或大麻素迁移437小时°C,5%一氧化碳2.JWH133(10μM)显著诱导巨噬细胞趋化性;然而DIAS2对巨噬细胞的迁移没有影响。数据为平均值±SEM,n = 3个生物复制。(B类-E类)将生物凝胶诱导的小鼠PEC放置在CIM-16板的上腔中,并允许其迁移3-4次37小时°C,5%一氧化碳2朝向指示的化合物。(B类)实时趋化性分析证实JWH133和HU308,而不是DIAS2(全部10μM),诱导PEC趋化性。(C类)化学动力学分析,比较载体或大麻素的所有组合(10μM),表明JWH133诱导了真正的趋化性。数据是每个条件下4个技术复制的一个实验的平均实时跟踪,是2个独立生物复制的代表。(D类,E类)浓度反应分析发现,JWH133和HU308均以浓度依赖的方式诱导PEC趋化性。数据均为平均值±扫描电镜,n = 4个生物重复,每个条件3-4个技术重复。(F类,G公司)将生物凝胶诱导的PEC放置在96孔E板中,允许粘附2-337小时°C,5%一氧化碳2然后,以指定浓度用载体或大麻素刺激细胞。(F类)显示细胞对JWH133(30、10、3和1μM)。数据是每个条件下2-3个技术重复的一个实验的平均轨迹。(G公司)浓度反应定量表明,JWH133和HU308以浓度依赖的方式导致巨噬细胞细胞骨架重排,EC50值5.3和1.6微米。数据均为平均值±扫描电镜,n = 3个生物复制,每个条件2-3个技术复制。采用单因素方差分析和Dunnett的多重比较校正进行统计分析。*P(P) < 0.05,**P < 0.01***P < 0.001,将所有样本与车辆对照进行比较。
图2
图2。巨噬细胞是生物凝胶诱导PEC向CB迁移的主要细胞群2激动剂。
(A类)流式细胞术分析表明中性粒细胞(F4/80)-, 7/4+)是生物凝胶诱导的PEC中的主要细胞群,而巨噬细胞(F4/80+, 7/4-)和单核细胞(F4/80+, 7/4+)只形成少数群体。(B类)将生物凝胶诱导的PEC放入培养皿中,并允许其粘附237小时°C,5%一氧化碳2然后将细胞在37℃放置过夜°C,5%一氧化碳2使用含有10mM乙二胺四乙酸。用F4/80和7/4染色后对这些细胞进行流式细胞术分析,结果表明,这一过程可显著增强巨噬细胞并清除中性粒细胞。(C类)富集的巨噬细胞(2×105)被放置在CIM-16板的上部腔室中,并允许迁移4次37小时°C,5%一氧化碳2朝向车辆(0.3%二甲基亚砜),5nM趋化因子或10μM大麻素。实时趋化性分析表明,JWH133和HU308导致该巨噬细胞群的强烈定向迁移。数据显示每个条件下3-4个技术重复的平均轨迹。(D类)流式细胞术F4/80和7/4分析表明,巨噬细胞是腹腔注射4%巯基乙酸诱发的主要细胞群。(E类,F类)硫乙醇酸诱导巨噬细胞(2×105)被放置在CIM-16板的上部腔室中,并允许迁移4次37小时°C,5%一氧化碳2朝向车辆(0.3%二甲基亚砜)或10μM大麻素。(E类)巯基乙酸的代表性实时趋化性示踪诱导巨噬细胞向JWH133、HU308或载体迁移。数据显示每个条件下3-4个技术重复的平均轨迹。(F类)趋化性定量分析表明,JWH133和HU308显著诱导巯基乙酸诱导巨噬细胞趋化。数据均为平均值±扫描电镜,n = 每种条件下4-6个生物重复,3-4个技术重复。采用单因素方差分析和Dunnett的多重比较校正进行统计分析。*P(P) < 0.05,**P < 0.01,将所有样本与车辆对照进行比较。
图3
图3。仅CB的子集2激动剂是主要的巨噬细胞趋化剂。
(A类-C类)生物凝胶诱导的小鼠PEC(4×105)被放置在CIM-16板的上部腔室中,并允许迁移3-4次37小时°C,5%一氧化碳2朝向车辆(0.3%二甲基亚砜),5nM趋化因子或10μM大麻素。(A类)趋化性测量为最大细胞指数减去起始细胞指数,数据显示为与向载体迁移的细胞相比的倍数变化。只有CCL5、JWH133、HU308、L-759656和L-759633作为化学引诱剂。2-AG的使用浓度为15微米。数据均为平均值±扫描电镜,n = 3-26个生物重复,每个条件有3-4个技术重复。(B类C类)趋化性阳性和趋化性阴性CB的代表性痕迹2激动剂。数据显示每个条件下3-4个技术重复的平均轨迹。采用单因素方差分析和Dunnett的多重比较校正进行统计分析。ns P>0.05,***P < 0.001,将所有样本与车辆对照进行比较。(D类,E类)生物凝胶诱导的PEC(5×104)放置在96孔E板中,允许粘附2-337小时°C,5%一氧化碳2然后,用载体(0.3%二甲基亚砜)或大麻素刺激细胞。(D类)浓度反应定量表明,L-759656以浓度依赖的方式引起细胞骨架重排,EC50值7.3微米。相比之下(D类)CP55940、AM1241、(E类)GP1a和WIN55212-2在任何浓度下都未能引起反应(JWH133曲线用于比较)。数据均为平均值±扫描电镜,n = 3个生物复制,每个条件2-3个技术复制。
图4
图4。对CB的趋化作用2选择性激动剂被百日咳毒素阻断,但不被CB阻断2或CB1反向激动剂。
生物凝胶诱导的PEC与任一载体孵育(A类) 200纳克/毫升百日咳毒素(PTX)90最小值或(B类) 130μM SR14452837分钟°C,5%一氧化碳2。治疗后,细胞迁移3-4次37小时°C,5%一氧化碳2朝向车辆,5nM化学试剂,5nM CCL5或10μM大麻素。对于使用SR144528的实验,1μM与指示的化学引诱剂一起添加到下室中。数据均为平均值±扫描电镜(A类)n个 = 4-11, (B类)n个 = 每种条件下进行3-10次生物重复和3-4次技术重复。(C类,D类)表达人CB的CHO-K1细胞2培养3037分钟°C,5%一氧化碳2带车辆或SR144528(1μM-最终分析浓度)。后续处理,车辆,JWH133(C类)或HU308(D类)添加到含有forskolin(FSK–20)的分析缓冲液中μM最终分析浓度),以给出指示的最终浓度。然后将细胞培养3037分钟°C,5%一氧化碳2在添加检测试剂之前。数据均为平均值±扫描电镜,n = 6. (E类)用载体或10刺激富集的巨噬细胞μM大麻素存在和不存在1μM SR144528。通过western blotting测定磷酸化ERK1/2和总ERK1/2的相对水平。Blot代表n = 3个独立的生物复制。(F类)生物凝胶诱导的小鼠PEC与载体或130μM SR141716A37分钟°C,5%一氧化碳2。治疗后,细胞迁移3-4次37小时°C,5%一氧化碳2朝向车辆或10μM大麻素。SR141716A第1页μM添加在所示大麻素旁边的下室中。数据均为平均值±扫描电镜,n = 4个生物重复,每个条件3-4个技术重复。对于所有数据,使用Sidak的多重比较校正,通过双向方差分析进行统计分析。ns P>0.05,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001,用于指示的比较P(P) < 0.001,与车辆+FSK相比。
图5
图5。JWH133、HU308和L-759656作为CB的化学引诱剂2-/-初级小鼠巨噬细胞。
生物凝胶从CB中诱导小鼠PEC2-/-将小鼠置于CIM-16板的上部腔室中,并允许其迁移3-4天37小时°C,5%一氧化碳2朝向车辆(0.3%二甲基亚砜),5nM CCL5或10μM大麻素。(A类)代表性痕迹显示趋化阳性CB2激动剂仍然是CB的化学引诱剂2-/-小鼠巨噬细胞。(B类)趋化性定量显示CCL5(5nM)、JWH133、HU308和L-759656(均为10μM)显著诱导CB2-/-巨噬细胞趋化性。数据均为平均值±扫描电镜,n = 5-15个生物重复,每个条件3-4个技术重复。(C类)CB的预处理2-/-生物凝胶通过PTX(200)诱导巨噬细胞纳克/毫升,9037分钟°C,5%一氧化碳2)显著降低JWH133和HU308诱导的趋化性(均为10μM)。数据均为平均值±扫描电镜,n = 3个生物复制,每个条件2-3个技术复制。(D类)生物凝胶诱发CB2-/-巨噬细胞被载体(0.3%二甲基亚砜)或10刺激μM大麻素。通过western blotting和密度分析测定磷酸化ERK1/2和总ERK1/2的相对水平,证实JWH133和HU308显著诱导ERK1/2磷酸化。数据均为平均值±扫描电镜,n = 6个生物复制。代表性的磷酸-ERK1/2印迹显示为插入物。(E类,F类)生物凝胶诱发CB2-/-巨噬细胞被放置在96孔E板中,允许粘附2-337小时°C,5%一氧化碳2然后,用载体(0.3%二甲基亚砜)或大麻素(10μM)。(E类)显示CB动力学的代表性痕迹2激动剂诱导的细胞骨架重排。(F类)定量分析表明,JWH133和HU308显著诱导CB中的细胞扩散2-/-小鼠巨噬细胞。数据均为平均值±扫描电镜,n = 每种条件下4-5次生物复制,3-4次技术复制。对于B类,D类,F类采用单因素方差分析和Dunnett多重比较校正进行统计分析。对于C类采用Sidak多重比较校正的双向方差分析进行统计分析*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001,将所有样本与车辆对照进行比较。
图6
图6。JWH133和HU308不会引起表达小鼠GPR18或GPR55的CHO细胞的细胞骨架重排。
CHO细胞(1×106)与2μg空载体或含有GPCR的载体混合,通过电穿孔转染,并在37℃放置过夜°C,5%一氧化碳2以允许标记的GPCR表达。(A-D公司)GPCR表面水平由流式细胞仪测定,并显示了代表性直方图。用空载体转染的细胞进行非特异性抗体染色。(A类)CB旗2, (B类)HA-GPR18和c-Myc-GPR55(C类)所有基因都有相似的表达水平。(D类)HA-C5aR1被用作阳性对照,并且显示出高的表面水平。(E-L公司)将转染的CHO细胞接种到96孔E板(25000个细胞/孔)中,并在37°C,5%一氧化碳2以达到稳定的基线。然后,用载体(0.3%二甲基亚砜)、C5a(10)刺激细胞nM)或大麻素(10μM)。(H(H))量化C5a诱导的反应发现,只有C5aR1转染的细胞对C5a(10nM;E类–代表性痕迹)。JWH133型(F类,),HU308(G公司,J)和CP55940(K(K))仅在CB中引起显著反应2转染细胞。重要的是,转染GPR18或GPR55的细胞对JWH133或HU308均无反应(,J). 异常大麻二酚(Abn-CBD;10μM)在任何GPCR转染细胞中均未引起反应(L(左)). 数据均为平均值±扫描电镜,n = 3-6次生物复制,每个条件2-3次技术复制。采用单因素方差分析和Dunnett的多重比较校正进行统计分析。*P(P) < 0.05,***P < 0.001,将所有样本与空载体转染细胞进行比较。
图7
图7。在241个GPCR中,JWH133仅在CB中引发β-抑制素的招募1和CB2.
JWH133(10μM)使用Discoverx PathHunter®eXpressβ-arrestin GPCR分析系统,在241个GPCR(分为两组)中测试其诱导β-arrestin募集的能力。(A类)GPCRMax面板由具有已知和验证的配体的GPCR组成。对于该面板,%激动剂活性计算为100%x(测试样品平均值-溶媒对照平均值)/(平均最大控制配体-溶媒控制平均值)。JWH133仅导致CB招募β-arrestin1和CB2. (B类)OrphanMax小组由没有验证配体的GPCR组成。对于该面板,%激动剂活性计算为100%x(测试样本平均值-车辆控制平均值)/(车辆控制平均数)。JWH133在GPR18或GPR55中均未引发β-arrestin募集。数据是指技术副本。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Pertwee R.G.大麻药理学:最初66年。英国药理学杂志。147补遗1 S163–171,10.1038/sj.bjp.0706406(2006)。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Pertwee R.G.等人,国际基础和临床药理学联合会。LXXIX公司。大麻素受体及其配体:超出CB(1)和CB(2)。药理学。第62版,588–631,10.1124/pr.110.003004(2010)。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Pertwee R.G.大麻素受体及其配体的药理学:综述。国际J.Obes。(伦敦)30 Suppl 1 S13–18,10.1038/sj.ijo.0803272(2006)。-内政部-公共医学
    1. Felder C.C.等人。人类大麻素CB1和CB2受体的药理学和信号转导的比较。摩尔药理学。48, 443–450 (1995).-公共医学
    1. Howlett A.C.大麻素受体信号。把手b。实验药理学。53–79 (2005).-公共医学

MeSH术语