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.2016年3月10日；35(10):1292-301.
doi:10.1038/onc.2015.187。 Epub 2015年6月1日。

MacroH2A1下调通过Lin28B的反式激活增强膀胱癌细胞的干样特性

S-J公园 1 2, J W垫片 1, H S公园 1, D-Y欧洲 1, M-T公园 1, J米易 1, S H Choi先生 1, S D Kim公司 1, T G儿子 1, W路 三, N D Kim（N D金） 2, K杨 1 4 5, K Heo公司 1
附属机构

MacroH2A1下调通过Lin28B的反式激活增强膀胱癌细胞的干样特性

S-J公园等。 癌基因. .

摘要

组蛋白变体macroH2A1在各种类型肿瘤的胚胎干细胞分化和肿瘤进展中具有重要作用。然而，macroH2A1对膀胱癌进展的调节作用尚未完全阐明。在这里，我们表明，macroH2A1敲除促进膀胱癌细胞的干样特性。膀胱癌细胞中macroH2A1的敲除增加了致瘤性、抗辐射性、活性氧物种的退化、球体形成能力的增加以及副产物比例的增加。我们发现，大分子H2A1是抑制Lin28B所必需的，Lin28B被确定为膀胱癌中大分子H2Al的新下游靶点。macroH2A1表达缺失与Lin28B表达水平升高显著相关，随后抑制成熟let-7 microRNA表达。此外，Lin28B的稳定过表达增强了由大分子H2A1缺失诱导的几种表型，包括致瘤性和球形形成能力。重要的是，Lin28B的表达受大分子H2A1介导的p300和EZH2/SV39H1的相互结合调控。我们的结果表明，Lin28B/let-7通路受到大分子H2A1及其辅因子的严格调控，在膀胱肿瘤的进展和膀胱癌细胞干样特性的调控中起着关键作用。

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数字

图1
图1
mH2A1缺失增强了膀胱癌细胞的干样特性。(一)将非选择性对照shRNA-expressing（NS）或sh-mH2A1-expressing（shM1）LD611细胞皮下注射到SCID小鼠体内(n个=5). 注射后30天监测肿瘤形成。(b)western blot分析评估mH2A1在LD611细胞中的敲除或再表达效率。(c（c）)将NS或shM1或mH2A1重新表达的LD611细胞皮下注射到裸鼠体内(n个=8). 在不同时间（顶部）测量肿瘤的平均大小，在终点（底部）测量肿瘤重量。(d日和e（电子）)NS或shM1 LD611细胞与补充B27、N2、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12孵育。1周后对球体进行计数和可视化(d日). 比例尺：100 微米。通过蛋白质印迹分析确定多能性因子的表达(e（电子）). 代表性数据(（f）)NS或shM1 LD611细胞未经处理或用1-5 利用克隆形成试验测定IR的Gy和细胞存活率。(克)红外线（5 Gy）处理或未处理的NS或shM1 LD611细胞在15天后被裂解 最小孵育时间。通过western blot分析评估检查点反应蛋白（总蛋白或磷酸化CHK1和CHK2）。(小时)NS或shM1 LD611细胞用5 μg/ml Hoechst 33342单独或在维拉帕米（150 μM（M）)采用荧光激活细胞分选法对侧群细胞进行分析。(我)用H处理NS或shM1 LD611细胞2O（运行）2(400 μM（M）)诱导氧化应激。活性氧浓度通过2′，7′-二氯荧光素双乙酸酯染色测定。P（P）-使用学生的t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图2
图2
Lin28B是mH2A1的下游目标。(一)我们在人类肿瘤干细胞标记物PCR阵列中鉴定了mH2A1靶基因。(b)采用western blot分析和qPCR检测Lin28B在NS或shM1膀胱癌细胞中的表达。(c（c）)使用抗Lin28B抗体通过免疫组化分析评估膀胱肿瘤组织微阵列。显示了原始放大倍数×20和×40。(d日)膀胱正常组织和恶性组织中macroH2A1和Lin28B的免疫染色分数。该图显示了得分不同（负、弱、中、强）的部分的百分比。P（P）-使用学生的t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图3
图3
mH2A1缺失通过Lin28B激活抑制let-7 miRNA表达。(一)用qPCR分析评估NS或shM1 LD611细胞中成熟let-7家族miRNA的水平。(b)将siLin28B（siLin）或siControl（siC）RNA瞬时转染到NS或shM1 LD611细胞中。用qPCR评价Lin28B基因敲除的效率。(c（c）)qPCR检测成熟let-7家族miRNAs的表达。SNORD61和SNORD68被用作内部控制。(d日)通过蛋白质印迹分析来分析let-7靶蛋白的表达。(e（电子）和（f）)在NS或shM1 LD611细胞中瞬时转染对照或Lin28B小干扰RNA，以及敲低Lin28B对细胞增殖的影响(e（电子）)和球体形成(（f）)已确定。(克)用western blot和qPCR检测Lin28B在LD611细胞中的敲除效率。(小时)裸鼠皮下注射NS或shLin28B LD611细胞(n个=10). 注射40天后，处死小鼠并测量肿瘤重量。P（P）-使用学生的t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图4
图4
Lin28B的激活与诱导的致瘤性和迁移增加相关。(一)用pCMV6-AC-GFP或pCMV6-Lin28B-GFP载体转染LD611细胞。为了产生一个稳定的细胞系，用基因素（50 μg/ml）。western blot分析证实Lin28B的表达。模拟：pCMV6载体表达细胞；Lin28B:pCMV6-Lin28B开放阅读框架载体表达细胞。(b和c（c）)用MTT法测定Lin28B过表达对膀胱癌细胞增殖的影响(b)和克隆形成(c（c）)分析。(d日)裸鼠皮下注射Mock或Lin28B LD611细胞(n个=5). 20天后，观察肿瘤肿块（左），并测量不同时间的平均肿瘤大小（右）。(e（电子）)评估Mock或Lin28B LD611细胞的迁移。(（f）)未经处理或使用1-5 利用克隆形成试验测定IR的Gy和细胞存活率。(克)用补充有B27、N2、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养Mock或Lin28B LD611细胞。1周后，对球体进行计数和可视化。P（P）-使用学生的t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图5
图5
p300或EZH2/SV39H1的相互结合调节Lin28B的表达。(一)位于林28BChIP分析中使用的位点。(b)进行ChIP分析以评估NS或shM1 LD611细胞中Lin28B启动子区域的mH2A1占有率。用mH2A1抗体免疫沉淀染色质。结果显示为输入染色质的百分比（1%）。GAPDH被用作内部控制；使用IgG作为抗体对照。(c（c）–小时)使用针对p300的抗体进行ChIP实验(c（c）)，H3K27ac(d日)、EZH2(e（电子）)，H3K27me3(（f）)，SUV39H1(克)和H3K9me3(小时).P（P）-使用学生的t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图6
图6
mH2A介导的致瘤性和癌干诱导中拟议调控机制的模型。在mH2A存在下，表观遗传阻遏物（EZH2/SV39H1）定位于Lin28B的启动子。因此，Lin28B的阻遏增强了成熟let-7 miRNA的产生。另一方面，mH2A的缺失通过向其启动子募集p300来上调Lin28B的表达，而Lin28B上调通过抑制成熟let-7 miRNA来刺激致瘤性和癌干。
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