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.2016年3月10日;35(10):1314-23。
doi:10.1038/onc.2015.190。 Epub 2015年6月1日。

基质细胞蛋白CCN1通过抑制代偿性增殖抑制肝癌的发生

附属公司

基质细胞蛋白CCN1通过抑制代偿性增殖抑制肝癌的发生

C-C陈等。 癌基因. .

摘要

肝细胞癌(HCC)是全球第三大癌症相关死亡原因,在美国呈上升趋势。先前的研究表明,基质细胞蛋白CCN1(CYR61)在肝损伤期间被诱导,并发挥限制和解决肝纤维化的作用。在这里,我们表明CCN1通过抑制致癌物诱导的代偿性肝细胞增殖来抑制肝癌的发生,从而限制受损和潜在致癌肝细胞的扩张。与肿瘤抑制一致,CCN1在人肝癌中表达下调。Ccn1肝细胞特异性缺失的Ccn1(ΔHep)小鼠受到肝癌致癌物二乙基亚硝胺(DEN)诱导的HCC肿瘤多样性增加。表达整合素α6β1结合缺陷Ccn1的Knockin小鼠(Ccn1(dm/dm))表型复制的Ccn1小鼠(ΔHep),表明Ccn1在这种情况下通过其α6βl结合位点发挥作用。CCN1通过整合素α6介导的活性氧物种(ROS)积累有效抑制表皮生长因子受体(EGFR)依赖的肝细胞增殖,从而触发p53激活和细胞周期阻滞。因此,Ccn1(dm/dm)小鼠表现出p53激活减弱和代偿性肝细胞增殖升高,导致HCC增加。此外,我们发现,在DEN诱导的损伤之前,单剂量的EGFR抑制剂厄洛替尼足以阻止代偿性增殖,并消除8个月后观察到的HCC结节的发展,这表明通过靶向CCN1抑制的EGFR依赖性肝细胞增殖,可能具有化学预防作用。综上所述,这些结果表明CCN1是一种损伤反应蛋白,其功能不仅限于限制肝纤维化,还通过抑制EGFR-依赖性肝细胞代偿性增殖抑制肝癌的发生。

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利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。CCN1在人肝癌组织中下调
A、 人肝癌组织芯片用抗CCN1抗体(棕色)染色,用苏木精(蓝色)反染。CCN1染色强度分为不可检测(1)、低(2)、中(3)和高(4),并用散点图表示。采用Mann-Whitney U检验分析正常与HCC以及不同级别HCC(T1至T3)之间的差异。每组的中值显示为红线。棒材:50μm。B、 表格汇总CCN1型Oncomine数据库中人肝癌组织mRNA表达分析。N: 正常组织;AC:肿瘤邻近的肝硬化组织。C、 Oncomine六个数据集的荟萃分析。
图2
图2。DEN诱导的肝癌增加通讯录1ΔHep通讯录1分/分老鼠
A、 DEN注射后8个月,小鼠肝脏出现表面HCC结节。条形图:1cm.B,H&E染色的肝组织切片显示肿瘤结节。C、 计算每只小鼠左外叶肿瘤结节的数量(2cm2)并绘制。水平线显示各组每只小鼠的平均肿瘤数,第页<0.001; 非配对t检验。D、 测量并绘制每只小鼠肿瘤结节的直径。显示的数据包括51个肿瘤通讯录1重量/重量小鼠,145个肿瘤抄送1分米/分米小鼠,33个肿瘤抄送1flox/flox公司小鼠和156个肿瘤通讯录1ΔHep老鼠。水平线表示肿瘤直径的中位数和亚中位数。N.S.,无统计差异。E、 对肝组织切片进行CCN1、PCNA和CD31免疫染色(棕色),并用苏木精(蓝色)进行反染色。所有基因型组的N=5,每只小鼠检查所有肿瘤结节,所示图片对每一组都具有代表性。P、 薄壁组织;T、 肿瘤。黄色条:0.5 mm,红色条:50μm,黑色条:20μm。
图3
图3。CCN1调节DEN注射后肝细胞增殖和凋亡
雄性小鼠(15日龄)注射DEN,1天后处死,检测肝脏凋亡和细胞增殖。A、 肝脏切片并染色TUNEL(红色)和DAPI(蓝色)。每只小鼠在5个随机高倍视野中计数凋亡细胞,平均值表示为平均值±s.d.(每组n=3)。实验重复3次,结果相似。B、 肝脏切片进行PCNA(绿色)和DAPI免疫染色。PCNA阳性细胞按上述方法计数。棒材:100μm。
图4
图4。CCN1通过整合素α抑制肝细胞DNA合成6和p53
A、 成人新鲜分离肝细胞通讯录1重量/重量,通讯录1ΔHep通讯录1分/分将小鼠与纯化野生型、DM和D125A CCN1蛋白(各10μg/ml)在37°C下孵育2天,并测定BrdU掺入量。在5个随机HPF中计数BrdU阳性细胞的百分比,并表示为三次测定的平均值±标准差。实验重复了三次,结果相似。B、 肝细胞来自通讯录1重量/重量小鼠与靶向整合素α的siRNA孵育6或αv(v)亚单位或非靶向对照,并用CCN1、EGF或两者处理,以及如上评估的BrdU掺入。通过靶整合素mRNA的qPCR证实了敲除(右)。C、 肝细胞中的p53和EGFR表达被siRNAs敲低(插入),细胞与CCN1进一步孵育,包括或不包括EGF,BrdU掺入分析如上。
图5
图5。CCN1通过ROS和p38 MAPK诱导p53核定位
A、 将原代肝细胞与CCN1、DM或D125A(10μg/ml)孵育1天,然后用抗p53抗体检测并用DAPI反染。在5个随机HPF中对核p53染色的细胞进行计数,并显示为三次测定的平均值±s.d。B、 细胞与野生型或突变型CCN1蛋白(含或不含BHA(0.1 mM))孵育1天。对分离的核裂解物进行电泳,并用抗p53、双磷酸化(Thr180/Tyr182)p38 MAPK、层粘连蛋白A/C和细胞色素C的抗体进行检测。C,将肝细胞与BHA(0.1 mM)或抗p38α的siRNA孵育1天,加或不加CCN1(10μg/ml),然后按上述方式进行p53定位染色。D、 肝细胞与BSA或CCN1(10μg/ml)孵育指定时间,然后加载DHC-AM,并用Hoechst 33342(蓝色)进行复染。在5个随机HPF中对ROS阳性细胞(绿色)进行计数,并显示为三次测定的平均值±标准差。E、 细胞与BSA、WT、DM和D125A CCN1(各10μg/ml)孵育1小时,加载DHC-AM,并如上检查ROS。F、 在添加CCN1 1小时并检测ROS之前,将肝细胞与NSC23766(NSC,0.1 mM)、apocynin(0.3 mM)或GoH3(0.1 mg/ml)预孵育30分钟。对照细胞与载体(DMSO)或非免疫大鼠IgG预先孵育。
图6
图6。CCN1调节p53激活和活性氧生成体内
A、 总肝蛋白裂解物通讯录1重量/重量通讯录1分/分在DEN注射后1或2天,用Western blotting检测小鼠(每组3只)的总抗体和Ser-15磷酸化p53、p21和β-actin抗体。带强度根据β-肌动蛋白标准化。B.DEN注射后1天收集的小鼠肝脏切片,免疫染色p53(棕色),并用苏木精(蓝色)进行复染。棒材:50μm。在5个随机HPF中计数核p53定位的细胞,并表示为平均值±s.d.(n=3;右)。C.在DEN注射后1天收集的小鼠肝脏与二氢乙硫酸氢钠在37°C下孵育5分钟,并通过荧光显微镜检查。用乙炔染色法从5个随机HPF中计数细胞核,并表示为平均值±s.d.(n=3;右)。棒材:50μm。
图7
图7。埃洛替尼抑制DEN诱导的肝细胞代偿性增殖和HCC
A中,通讯录1分米/分米在DEN注射前3小时向小鼠(n=3)注射厄洛替尼(50 mg/Kg),1天后收集肝脏。免疫染色后,在5个随机HPF中计数PCNA阳性细胞(右)。棒材=50μm。B。通讯录1分/分如上所述,用厄洛替尼和DEN治疗小鼠,8个月后收集肝脏并检查肿瘤。在组织切片中计算HCC的数量(2 cm2)(右)。水平线显示每只小鼠的肿瘤中位数:不含厄洛替尼的对照小鼠,15只(n=10);厄洛替尼治疗,0.5(n=4)。第页<0.001; 非配对t检验。棒材=1cm。

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