Hematopoietic stem cell-derived cancer-associated fibroblasts are novel contributors to the pro-tumorigenic microenvironment

doi:10.1016/j.neo.2015.04.004

.2015年5月；17(5):434-48.

doi:10.1016/j.neo.2015.04.004。

造血干细胞衍生的癌相关成纤维细胞是促肿瘤微环境的新贡献者

附属公司

¹美国南卡罗来纳州查尔斯顿市拉尔夫·H·约翰逊退伍军人事务医疗中心研究服务部；美国南卡罗来纳医科大学病理学和实验医学系，南卡罗莱纳州查尔斯顿；美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学霍林斯癌症中心。
²美国南卡罗来纳医科大学研究生院，南卡罗莱纳州查尔斯顿。
^三美国南卡罗来纳医科大学心胸研究部外科。
⁴美国南卡罗来纳州查尔斯顿市拉尔夫·H·约翰逊退伍军人事务医疗中心研究服务部；美国南卡罗来纳医科大学心胸研究部外科。
⁵美国南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心；美国南卡罗来纳医科大学医学系。
⁶美国南卡罗来纳医科大学病理学和实验医学系，南卡罗莱纳州查尔斯顿；美国南卡罗来纳州查尔斯顿市南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心。
⁷美国南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心；美国南卡罗来纳医科大学微生物与免疫学系。
⁸美国南卡罗来纳州查尔斯顿市拉尔夫·H·约翰逊退伍军人事务医疗中心研究服务部；美国南卡罗来纳医科大学病理学和实验医学系，南卡罗莱纳州查尔斯顿；美国南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心。电子地址：laruerc@musc.edu。

PMID： 26025666
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内政部： 2016年10月10日/j.neo.2015.04.004

造血干细胞衍生的癌相关成纤维细胞是促肿瘤微环境的新贡献者

林赛·T·麦克唐纳等。肿瘤形成. 2015年5月.

.2015年5月；17（5）：434-48。

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附属公司

¹美国南卡罗来纳州查尔斯顿市拉尔夫·H·约翰逊退伍军人事务医疗中心研究服务部；美国南卡罗来纳医科大学病理学和实验医学系，南卡罗莱纳州查尔斯顿；美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学霍林斯癌症中心。
²美国南卡罗来纳医科大学研究生院，南卡罗莱纳州查尔斯顿。
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⁴美国南卡罗来纳州查尔斯顿市拉尔夫·H·约翰逊退伍军人事务医疗中心研究服务部；美国南卡罗来纳州查尔斯顿市南卡罗来纳医科大学心胸研究部外科。
⁵美国南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心；美国南卡罗来纳医科大学医学系。
⁶美国南卡罗来纳医科大学病理学和实验医学系，南卡罗莱纳州查尔斯顿；美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学霍林斯癌症中心。
⁷美国南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心；美国南卡罗来纳医科大学微生物与免疫学系。
⁸美国南卡罗来纳州查尔斯顿市拉尔夫·H·约翰逊退伍军人事务医疗中心研究服务部；美国南卡罗来纳医科大学病理学和实验医学系，南卡罗莱纳州查尔斯顿；美国南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心。电子地址：laruerc@musc.edu。

PMID： 26025666
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内政部： 2016年10月10日/j.neo.2015.04.004

摘要

靶向肿瘤微环境对于提高癌症治疗的有效性至关重要。癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境中最丰富的细胞类型之一，在肿瘤进展中起着重要作用。CAF有多种来源，包括常驻成纤维细胞、脂肪细胞和骨髓。我们的实验室先前确定了CAF的一种新的造血干细胞来源；然而，HSC-衍生CAF（HSC-CAF）在肿瘤进展中的功能作用尚未被研究。为了验证HSC-CAF通过促进细胞外基质（ECM）和旁分泌产生促血管生成因子促进肿瘤进展的假设，我们开发了一种分离HSC-CAFs的方法。根据造血和成纤维细胞标记物在两种小鼠肿瘤模型中的表达，对HSC-CAF进行了分析。剖面分析揭示了与ECM沉积和重塑相关的因素的产生。体内功能研究表明，与肿瘤细胞共同注射HSC-CAF可提高肿瘤生长率，并显著大于单独注射肿瘤细胞。免疫组织化学研究显示联合注射后血管密度增加，表明HSC-CAF在肿瘤血管化中起作用。体外机制研究表明，HSC-CAF在内皮管形成和图样形成中，在生成血管内皮生长因子a和转化生长因子-β1中发挥作用。体外和体内研究结果表明，HSC-CAF是肿瘤微环境的关键组成部分，并表明靶向新型HSC-CAF可能是一种有前途的治疗策略。

爱思唯尔公司出版。

PubMed免责声明

数字

**补充图S1**
qRT-PCR：RT和PCR步骤控制。显示原代皮肤成纤维细胞中α-SMA、Col I、vimentin、FAP、CD45、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-14的mRNA表达。按照材料和方法一节中的描述，将相对表达式归一化为RPL13A。

**补充图S2**
无一级抗体染色对照。每种抗体的形态学（DIC）、细胞核（HO）、EGFP表达（绿色）和二级对照染色。（A和B）对于图1、2和3中使用的每种抗体，呈现了用二级抗体染色而不添加一级抗体的LLC肿瘤衍生的HSC-CAF的代表性图像。（C和D）来源于E0771肿瘤的HSC CAFs的染色对照描述，如图8所示。棒材，25μm（A–D）。

图1
从克隆移植小鼠中分离HSC-CAF。（A） EGFP的代表形象⁺（HSC衍生）和EGFP⁻从克隆移植小鼠中生长的LLC肿瘤中分离出的细胞（星号）。（B） HSC-CAF（黑条）和LLC肿瘤细胞（阴影条）CD45表达的qRT-PCR分析**P（P）*≤ .0001). （C）典型分离细胞的DIC和免疫荧光染色显示形态（DIC）、细胞核（Hoechst染料，HO）、EGFP表达和CD45（Ab染色）。合并图像（右图）表示EGFP、HO和抗体染色（Ab染色）。补充图S2中描述了免疫荧光图像的仅二级（无一级抗体）对照。棒材，100μm（B）和25μm（D）。从克隆移植小鼠中分离HSC-CAF。（A） EGFP的代表形象⁺（HSC衍生）和EGFP⁻从克隆移植小鼠中生长的LLC肿瘤中分离出的细胞（星号）。（B） HSC-CAF（黑条）和LLC肿瘤细胞（阴影条）CD45表达的qRT-PCR分析**P（P）*≤ .0001). （C）典型分离细胞的DIC和免疫荧光染色显示形态（DIC）、细胞核（Hoechst染料，HO）、EGFP表达和CD45（Ab染色）。合并图像（右侧面板）表示EGFP、HO和抗体染色（Ab染色）。补充图S2中描述了免疫荧光图像的仅二级（无一级抗体）对照。棒材，100μm（B）和25μm（D）。

图2
克隆移植小鼠HSC-CAF的特征。（A）活化成纤维细胞标记物的qRT-PCR分析*第一列*(**P（P）*≤ .0001),*α-SMA*(**P（P）*= .0031),*FAP公司*(**P（P）*=.0121），以及*波形蛋白*(**P（P）*≤.0001）在HSC-CAF（黑色条）和LLC肿瘤细胞（阴影条）中。（B） qRT-PCR分析*基质金属蛋白酶2*(**P（P）*= .0035),*基质金属蛋白酶-3*(**P（P）*≤ .0001),*基质金属蛋白酶-9*(**P（P）*≤ .0001),*和MMP-14*(**P（P）*=.0002）在克隆移植小鼠和LLC肿瘤细胞（阴影条）的HSC-CAF（黑色条）中。（C）典型分离细胞的DIC和免疫荧光染色显示形态（DIC）、细胞核（Hoechst染料，HO）以及EGFP、Col I、α-SMA、vimentin、F4/80和WS-CyK的表达。棒材，25μm（C）。

图3
HSC-CAF的表达谱。（A） qRT-PCR分析*CD45型*在从注射LLC肿瘤细胞（黑条）和LLC瘤细胞（阴影条）的非转基因小鼠分离的HSC-CAF中**P（P）*≤ .0001). （B）描述了DIC和EGFP的代表性免疫荧光染色、HSC-CAF中的核（Hoescht染料，HO）和CD45（Ab染色）表达。（C）活化成纤维细胞标记物的qRT-PCR分析*第一列*(**P（P）*= .0001),*α-SMA*(**P（P）*≤ .0001),*FAP公司*(**P（P）*=.0176），以及*波形蛋白*(**P（P）*≤.0001）在HSC-CAF（黑色条）和LLC肿瘤细胞（阴影条）中。（D） qRT-PCR分析*基质金属蛋白酶-2*(**P（P）*= .5931),*基质金属蛋白酶-3*(**P（P）*≤ .0001),*基质金属蛋白酶-9*(**P（P）*=0.0012），以及*基质金属蛋白酶-14*(**P（P）*=.0007）在HSC-CAF（黑色条）和LLC肿瘤细胞（阴影条）中。（E）描述了DIC和代表性免疫荧光染色的细胞核（Hoescht染料，HO）、EGFP、Col I、α-SMA和波形蛋白（Ab染色）在HSC-CAF中的表达。棒材，25μm（B、E）。

图4
HSC-CAF有助于促肿瘤微环境。（A）典型的流式细胞术分析显示，共表达CD45和Col I的EGFP表达细胞的百分比（68%，左侧）和共表达CD44和α-SMA的EGFP-表达细胞的比例（90%，右侧）。闸门的设置基于荧光减一（FMO）控制。（B） Western blot分析显示，从三个生物复制品（M1、M2和M3）分离的HSC-CAF中，Col I和α-SMA分别有150和42 kDa条带；β-actin负荷控制如下所示。（C） HSC-CAF-CM（黑色方块）和αMEM（空白圆圈）的功能性MMP活性测定表明HSC-CAF-CM含有活性MMP(**P（P）*≤ .05).

图5
HSC-CAF对肿瘤生长和血管形成的影响。肿瘤大小（A）和质量（B）的测量表明，LLC+CAF联合注射（空三角形）导致肿瘤变大与LLC（空圈）注入队列(**P（P）*< .05). 在CAF（黑方块）队列中未观察到肿瘤。（C）从LLC和LLC+CAF队列中提取的肿瘤；LLC+CAF队列肿瘤的大小和粗大血管增加。（D）抗GFP免疫荧光染色（红色）显示EGFP⁺HSC-CAF人群持续存在于LLC+CAF肿瘤队列的终点（上部面板）。下部面板中未显示初级抗体染色。合并图像中，赫斯特核染色用蓝色表示。（E） CD31的免疫组织化学染色和苏木精复染显示LLC+CAF队列中的血管增加（用星号表示的血管）。（F）从免疫组织化学染色图像中定量LLC（白色条）和LLC+CAF（黑色条）中的血管(**P（P）*< .05). 棒材，25μm（D）。

图6
HSC-CAF-CM支持HUVEC管的形成。（A）用αMEM（阴性对照）、HUVEC培养基（阳性对照）或HSC-CAF-CM处理的细胞进行HUVEC-管形成试验。用DIC显微镜（左侧）和Calcein AM染料（右侧）观察管和血管模式。（B）量化节点数、节段数和Ma:Mv。在B中**P（P）*与αMEM相比<0.05；ns，不显著。棒材，250μm（A）。

图7
HSC-CAF中的VEGF-A和TGF-β促进HUVEC管的形成。（A） HSC-CAF-CM（黑条）和皮肤成纤维细胞-CM（白条）中VEGF-A（左侧）和TGF-β1（右侧）的ELISA检测**P（P）*< .05). （B）对HSC-CAF（黑条）和皮肤成纤维细胞（白条；阳性对照）中VEGF-A（左面板）和TGF-β1（右面板）mRNA表达的qRT-PCR分析。（C）在HSC-CAF-CM中添加VEGF-A或TGF-β中和抗体的HUVEC试管形成分析的DIC（左面板）和Calcein AM染料（右面板）代表性图像**P（P）*< .05). 量化了Ma面积、Mv面积和Ma:Mv的比值。在D中**P（P）*与HSC-CAF-CM.Bar相比，<.05，250μm（C）。

图8
HSC-CAF导致小鼠乳腺癌。（A） E0771肿瘤（黑条）和E0771癌细胞（阴影条）HSC-CAF中CD45表达的qRT-PCR分析**P（P）*≤ .0001). （B）代表性E0771 HSC-CAF的DIC和免疫荧光染色显示形态学（DIC）、细胞核（Hoechst染色，HO）、EGFP表达和CD45（Ab染色）。成纤维细胞标志物Col I的（C，D）qRT-PCR分析（C）(**P（P）*≤.0001），α-SMA(**P（P）*=.0104），FAP(**P（P）*=0.0016）和波形蛋白(*P（P）*=0.0082）和（D）MMP-2(**P（P）*≤.0001），MMP-3(**P（P）*=0.0013），MMP-9(**P（P）*≤0.0001）和基质金属蛋白酶-14(**P（P）*≤.0001）在E0771 HSC-CAF（黑色条）和E0771肿瘤细胞（阴影条）中。（E）代表性E0771 HSC-CAF的DIC和免疫荧光染色显示形态学（DIC）、细胞核（HO）、EGFP表达、抗体（Col I、α-SMA、vimentin、F4/80、WS-CyK）染色（Ab染色）和代表性细胞的融合图像。（F）用αMEM（阴性对照）、HUVEC培养基（阳性对照）或E0771 HSC-CAF-CM处理的细胞进行HUVEC-管形成分析。用DIC显微镜（左侧）和钙调素AM染料（右侧）观察管和血管模式。（G）量化F的节点数（左侧面板）、节段数（中间面板）和Ma:Mv（右侧面板）。在G中**P（P）*与αMEM和^ψ*P（P）*与HUVEC培养基相比=.0280。棒材，25μm（A、C）和250μm（F）。

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1. McDonald L.T.、LaRue A.C.造血干细胞衍生的癌相关成纤维细胞：一种新来源。国际临床实验病理学杂志。2012;5:863–873.-项目管理咨询公司-公共医学

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