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.2015年8月；1849(8):919-29.
doi:10.1016/j.bbagrm.2015.05.005。 Epub 2015年5月21日。

EMT/MET动力学的表观遗传控制：HNF4α通过miRs-29影响DNMT3s

卡拉·西奇尼 1, 瓦莱丽亚·德诺诺 2, 塞西莉亚·巴蒂斯特利 2, 安吉拉·玛丽亚·科佐利诺 三, 马可·德桑蒂斯·普佐尼亚 2, 西尔维娅·安娜·西亚弗雷 4, 查德·布罗克 5, 弗兰克·冈萨雷斯 5, 劳拉·阿米科内 2, 马可·特里波迪 6
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EMT/MET动力学的表观遗传控制：HNF4α通过miRs-29影响DNMT3s

卡拉·西奇尼等。 Biochim生物物理学报. 2015年8月.

摘要

背景和目标：上皮-间充质转化（EMT）和逆间充质-上皮转化（MET）是细胞可塑性的表现，意味着动态而深刻的基因表达重编程。虽然DNA甲基化保证了控制整个转录谱协调调节的主要表观遗传密码，但EMT/MET动力学中的DNA甲基转移酶（DNMT）活性在很大程度上仍未被探索。在这里，我们研究了MET的主效应器HNF4α与DNMT 3A和3B从头调节直接相关的分子机制。

方法：通过RT-qPCR、Western blotting和免疫细胞化学分析评估EMT/MET标记、microRNA29和DNMT3s表达之间的相关性。通过抗miR、microRNA前体和化学抑制剂测试microRNA和DNMT3的功能作用。利用ChIP研究HNF4αDNA结合活性。

结果：HNF4α沉默足以诱导DNMT3B、体外分化肝细胞以及体内肝细胞特异性HNF4α敲除小鼠和体外DNMT3A的正向调节，但不诱导DNMT1的正向调节。在探索这些观察结果背后的分子机制时，已经收集到以下证据：（i）DNMT3水平与其调节因子miR-29a和miR-29b的表达之间存在负相关；（ii）HNF4α作为miR-29a-b转录的直接调节因子的作用。值得注意的是，在TGFβ诱导的EMT过程中，DNMT3的关键功能已被证明，因此提示需要抑制这些DNMTs以维持分化表型。

结论：HNF4α通过调节miR-29a和-29b的表达来维持肝细胞的特性，而miR-29b的表达反过来又通过限制DNMT3A和DNMT3B的水平来控制表观遗传修饰。

关键词：从头DNA甲基化；上皮-间质转化；肝细胞；转化生长因子β；miR-29。

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数字

图1。
图1。
HNF4α沉默诱导肝细胞中的DNMT3A和DNMT3B。（A） 左面板：与对照siGFP细胞相比，HNF4α沉默（48小时）（siHNF4β）中指示基因的RT-qPCR分析。这些值通过ΔΔCt方法计算，并表示为相对于对照的相对值（任意值=1）。右侧面板：siHNF4α和siGFP细胞总蛋白提取物的Western blot和密度分析。WB图表示三个独立实验中的一个指示性实验。通过CDK4免疫印迹归一化的蛋白质量的密度滴定值表示为与对照组相比的表达倍数（siGFP）。三个独立实验的统计差异显著（*p<0.05，***p<0.001）。对siHNF4α和siGFP细胞中的指示标记进行RT-qPCR（上面板）和Western blot（中面板）分析。报告了三个独立实验的密度分析（下面板）和统计显著性差异（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；无显著性差异）。蛋白量通过CDK4免疫印迹归一化，WB图表示三个独立实验中的一个指示性实验。（B） 6种肝细胞特异性蛋白提取物指示标记的Western blot分析Hnf4α敲除（KO）小鼠(Hnf4a型飞行/飞行；AlbERT2核心; PMID:22241473）和6个匹配的Cre阴性室友(Hnf4a型+/+). 如图所示，蛋白质量通过α-β肌动蛋白免疫印迹法进行标准化。报告了密度分析和统计显著性差异（**pμ0.01；***pμ0.001；无显著性差异）。
图2。
图2。
HNF4α控制miR-29a和miR-29b的表达。（A） siHNF4α和siGFP细胞上指示的小鼠微小RNA的RT-qPCR分析，如图所示。1。这些值通过ΔΔCt方法计算，并表示为相对于对照的相对值（任意值=1）。报告了三个独立实验的统计显著差异（**pμ0.01）。（B） 5只肝细胞特异性HNF4α-KO小鼠肝脏样品中指示miR的RT-qPCR分析(Hnf4α飞行/飞行；AlbERT2核心; PMID:22241473）和5个匹配的Cre阴性室友(Hnf4α+/+). 通过ΔΔCt方法计算值，并报告统计学上的显著差异（*pμ0.05，***pμ0.001）。（C） 用抗HNF4α抗体或正常兔IgG作为阴性对照，对经或未经TGFβ处理的细胞（NT）染色质进行24小时的ChIP分析的qPCR分析，显示内源性HNF4 a在miR-29a-b启动子上直接募集。与非特异性基因组区域（ns）相比，特定HNF4α共识（miR-29 a–b）上的ChIP均归一化为总染色质输入，并表示为（IP-NoAb），以暗条显示，（IgG-NoAb）以白色条显示。报告了三个独立实验的统计显著性差异（**pμ0.01；***pμ0.001；无显著性差异）。
图3。
图3。
TGFβ处理诱导肝细胞中的DNMT3A和DNMT3B。（A） 对经TGFβ处理（TGFβ）或未经处理（NT）细胞24小时（放大×20）的指示上皮（E-cadherin）和间充质（Snail、Vimentin、MMP9）标记物进行免疫荧光分析。蓝色DAPI染色显示细胞核（DNA）。（B） RT-qPCR分析按（A）处理的细胞中指示的miR。这些值通过ΔΔCt方法计算，并表示为相对于对照的相对值（任意值=1）。报告了三个独立实验的统计显著差异（**pμ0.01）。（C） RT-qPCR分析细胞总RNA上的指示标记，如（A）所示。报告了三个独立实验的统计显著差异（*pμ0.05，***pμ0.001）。（D） 蛋白质提取物上细胞指示标记的Western blot分析，如（A）所示。如图所示，通过CDK4或微管蛋白的免疫印迹使蛋白质数量标准化。数字表示三个独立实验中的一个指示性实验。报告了三个独立实验的密度分析和统计显著性差异（*pμ0.05，***pμ0.001）。
图4。
图4。
在TGFβ介导的EMT诱导中需要DNMT。（A） 对经5-氮胞苷（5-Aza）处理或未经处理（NT）72小时、经TGFβ（TGFβ）处理24小时或两者（5-Aza+TGFβ，放大×20）的细胞进行指示上皮（E-cadherin）和间充质（Snail，MMP9）标记物的免疫荧光分析。蓝色DAPI染色显示细胞核（DNA）。（B） RT-qPCR分析蜗牛、E-cadherin、Mmp9和Vimentin如（A）所示生长的细胞上的表达。通过ΔΔCt方法计算这些值，并将其表示为相对于对照组的相对值（任意值=1），报告了三个独立实验的统计显著性差异（*pμ0.05，**pμ0.01，***pμ0.001）。
图5。
图5。
miR-29b过度表达干扰TGFβ介导的EMT。（A） 对过度表达阴性对照microRNA前体（Ctrl）或等量的前miR-29b，并经TGFβ处理或不处理24小时（放大倍率×20）的细胞进行指示上皮（E-cadherin）和间充质（Snail，MMP9）标记物的免疫荧光分析。蓝色DAPI染色显示细胞核（DNA）。（B） 在上述相同条件下，对细胞上的指示基因进行RT-qPCR分析。这些值通过ΔΔCt法计算，并如上所示。数据表示为三份样品的平均值±SD。三个独立实验报告了统计学上的显著差异（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。（C） 在上述相同条件下，对细胞总蛋白提取物的指示标记进行Western blot分析。如图所示，通过CDK4或微管蛋白的免疫印迹使蛋白质量标准化。数字表示三个独立实验中的一个指示性实验。报告了三个独立实验的密度分析和统计显著性差异（*p<0.05，**p<0.01，无显著性差异）。（D） 用阴性对照microRNA抑制剂（anti-miRs NC）或一组miR-29a和miR-29b抑制剂（anti miRs 29ab）瞬时转染细胞并沉默DNMT3A和B（siDNMT3s）或作为GFP（siGFP）对照的指示标记的Western blot分析和密度分析。如图所示，通过CDK4或微管蛋白的免疫印迹使蛋白质量标准化。数字表示三个独立实验中的一个。报告了三个独立实验的统计显著性差异（*p<0.05，**p<0.01；无显著性差异）。
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