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.2015年5月20日；6(14):11959-78.
doi:10.18632/oncotarget.3551。

单一药物对TGF-β途径的系统衰减同时恢复同一古老哺乳动物的海马神经发生和肌肉发生

哈纳迪·尤瑟夫 1 2, 迈克尔·康博伊 三, 亚当·摩根塔勒 三, 克里斯蒂娜·施莱辛格 三, 卢卡斯·布加杰 三, 普雷蒂·帕利瓦尔 三, 克里斯托弗·格里尔 三, Irina M Conboy公司 三, 大卫·沙弗 三 4 5
附属机构

单一药物对TGF-β途径的系统衰减同时恢复同一古老哺乳动物的海马神经发生和肌肉发生

哈纳迪·尤瑟夫等。 Oncotarget公司. .

摘要

干细胞功能随着年龄的增长而下降，这主要是由于其组织生态位中的生化失衡，这项研究表明，年龄增加导致海马神经原生态位中转化生长因子β（TGF-β）信号的升高，类似于先前显示的骨骼肌肌源性生态位随年龄的变化。探索年轻人校准关键信号通路可能促进多个旧组织再生的假设，我们发现用单一药物系统性减弱TGF-β信号同时促进同一老年小鼠的神经发生和肌肉再生，这一发现通过基因扰动进一步证实。在细胞机制的水平上，我们的结果证实，老年海马干细胞壁龛中TGF-β1的年龄特异性增加涉及小胶质细胞，并且这种增加在大脑和肌肉中都是促炎性的，正如MHC I类分子组成部分β2微球蛋白（B2M）的高表达所证明的那样。这些发现表明，在典型的老年组织中，TGF-β1的高水平促进炎症，而不是其在减弱免疫反应中的典型作用。与此结论一致，TGF-β1信号的抑制使两种研究组织中的B2M正常化到年轻水平。

关键词：Gerotarget；TGF-β信号转导；老化；肌发生；神经发生；干细胞微环境。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明，他们在这项工作中没有已知的利益冲突。

数字

图1
图1。小鼠海马局部TGF-β随年龄增加
答：。幼鼠（2个月）和老年鼠（24个月）(n个=3）每天服用BrdU，持续5天，然后进行灌注和PFA固定。对Sox2（绿色）和BrdU（红色）进行免疫荧光（IF），DAPI（蓝色）标记所有细胞核。显示了具有代表性的图像。比例尺=100μM。B。qRT-PCR定量玻璃纤维蛋白1青年和老年海马的mRNA表达。相对平均表达水平标准化为GAPDH公司并表示为相对于年轻海马的平均表达水平。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 0.003). 误差条表示平均值的标准误差(n个=每组4个生物重复）。C、。在灌注和PFA固定的年轻和老年脑组织切片上进行免疫荧光(n个=3），Sox2（绿色）和TGF-β1,2,3（红色），Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了典型的低倍和高倍图像。比例尺=50μM。D。使用ImageJ计算年轻和老年齿状回组织切片中TGF-β1,2,3免疫荧光的积分像素强度。像素强度是相对于年轻齿状回的t吨-测试(*第页<0.003）。误差条表示平均值的标准误差(n个=3个年轻的，3个老的生物复制品）。E.公司。对年轻和老年海马蛋白提取物进行ELISA，以评估局部TGF-β1的水平，并表示为pg TGF-。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 0.01). 误差条表示平均值的标准误差(n个=4个年轻的，5个老的生物复制品）。
图2
图2。小胶质细胞和内皮细胞表达TGF-β
答：。在灌注的旧脑组织切片上进行免疫荧光检测TGF-β1,2,3（绿色）、小胶质细胞标记物Iba1（红色）和星形胶质细胞标记GFAP（灰色），并用Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了典型的低倍和高倍图像。比例尺=50μM。箭头表示TGF-β和Iba1共定位区域。B。在灌注的年轻脑组织切片上进行TGF-β1,2,3（绿色）、Iba1（红色）和GFAP（灰色）的免疫荧光，Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了典型的低倍和高倍图像。比例尺=50μM。箭头表示TGF-β和Iba1共定位区域。C、。在灌注的旧脑组织切片上进行免疫荧光检测TGF-β1,2,3（绿色）、内皮标记物CD31（红色）和Sox2（灰色），并用Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了典型的低倍和高倍图像。比例尺=50μM。箭头表示TGF-β和CD31共定位区域。D。在灌注的年轻脑组织切片上进行免疫荧光检测TGF-β1,2,3（绿色）、CD31（红色）和Sox2（灰色），并用Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了典型的低倍和高倍图像。比例尺=50μM。箭头表示TGF-β和CD31共定位的区域。
图3
图3。小鼠海马TGF-β信号转导的下游效应物随年龄增长而增加并抑制神经祖细胞增殖
答：。在年轻和老年脑组织切片上进行Sox2（绿色）和pSmad3（红色）的免疫荧光染色(n个=4名年轻人，6名老年人），DAPI（蓝色）标记所有细胞核。显示了具有代表性的图像。比例尺=50μM。B。MetaXpress图像量化用于计算齿状回SGZ中Sox2+神经干和祖细胞的平均像素强度。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 0.001). 误差条表示平均值的标准误差(n个=4岁，6岁）。C、。qRT-PCR定量第21页青年和老年海马的mRNA表达。相对平均表达水平标准化为GAPDH公司与年轻的河马有关。学生的t吨-测试（双尾）(*第页<0.003），误差条表示平均值的标准误差(n个=每组3个年轻的，3个老的生物重复）。D。在有或无TGF-β1（50 ng/mL）的生长培养基中培养30分钟的NPC的TGF-？下游效应物pSmad3的免疫印迹分析。与总SMAD2/3水平相比，pSmad3信号通过TGF-β1诱导。E.公司。增加TGF-β1的功能验证。NPC在生长培养基（DMF12+N2+10 ng/mL FGF-2）中培养24小时，有无TGF-β1（100 ng/mL）。在细胞固定前进行2小时BrdU（10μM）脉冲以标记增殖细胞。对BrdU（绿色）和Sox2（红色）进行染色，用Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了具有代表性的图像。比例尺=100μM。F、。使用自动成像仪和MetaXpress细胞评分软件，通过对每种情况的25个随机区域进行细胞评分来量化NPC的增殖。结果分别显示为BrdU+增殖NPC+/−SD的平均百分比。学生的t吨-测试（双尾）(*第页<0.0003），误差条表示平均值的标准误差(n个=4个生物复制品）。
图4
图4。老年小鼠海马神经发生和肌发生的系统性部分挽救体内TGF-β的抑制
答：。Alk5抑制剂给药示意图。老龄（2岁）小鼠接受IP注射TGF-βI型受体激酶Alk5抑制剂（Alk5i）或溶媒对照，每天注射一次，持续11天（第−6天到第4天），并在第5天处死。在第0天，胫骨前部（TA）被心脏毒素损伤，小鼠开始在第4天每天注射BrdU。伤后第5天（5 dpi）收集TA。B。灌注和PFA固定后，Alk5抑制剂或载体处理小鼠的脑切片(n个=4个/组）对整个海马体进行BrdU（红色）和Sox2（绿色）免疫染色，并用Hoechst（蓝色）标记细胞核。显示了具有代表性的图像。比例尺=50μM。C、。每个齿状回BrdU+Sox2+细胞的体视学定量。如图所示，Alk5 I型受体激酶抑制剂增加了齿状回中BrdU+Sox2+细胞的平均数量。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 5 × 10−7). 误差条表示平均值的标准误差(n个=4个年轻的，4个老的生物复制品）D。伤后5天收集的TA肌肉切片进行eMyHC（绿色）免疫染色，并用Hoechst（蓝色）标记细胞核。有代表性的图像显示受伤肌肉切片中新再生的肌纤维。损伤部位的苏木精和伊红染色也显示出来。比例尺=100μM。E.公司。再生指数量化了受伤区域每平方毫米新形成的eMyHC+肌纤维的数量。各组的平均再生指数显示，全身施用Alk5抑制剂可增强损伤后的老肌肉再生。学生的t吨-测试（双尾）(*第页<0.0002），误差条表示平均值的标准误差(n个=每组4个生物重复）。
图5
图5。老年海马神经再生的抢救体内遗传抑制形状记忆合金3
答：。立体定向慢病毒注射实验示意图。年龄大（18个月大）的小鼠将编码shRNA的慢病毒载体立体定向注射到海马（来自bregma的坐标：AP:−2.12，ML:+/-1.5，VD:−1.55）Smad3公司或lacZ公司让小鼠恢复14天，然后每天腹腔注射BrdU（50 mg/kg）5天，然后进行分析。B。大脑切片lacZ公司或Smad3公司shRNA注射小鼠(n个= 5lacZ公司shRNA慢病毒，4Smad3公司用GFP（绿色）、BrdU（红色）和Sox2（灰色）免疫染色，用Hoechst（蓝色）标记细胞核。显示了典型的低倍和高倍图像。比例尺=50μM。高倍图像中的箭头表示转导、增殖的NPC。C、。量化每个齿状回BrdU+Sox2+细胞的平均数量表明，在老年动物中表达抗-Smad3公司shRNA。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 0.05). 误差条表示平均值的标准误差(n个= 5lacZ公司shRNA，4Smad3公司shRNA大脑）。D。定量shRNA注射大脑中BrdU+GFP+Sox2+增殖NPCs与BrdU-GFP+Sox2+NPCs的平均百分比表明，shRNA导致增殖神经前体细胞增加-Smad3公司与shRNA相比的转导-lacZ公司对照小鼠。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 4 × 10−7)，误差条表示标准偏差(n个= 3).
图6
图6。通过以下途径挽救老年肌肉的肌生成并增强NPC增殖体内TGF-β受体II的遗传抑制
答：。示意图。第0天，老龄（18个月大）小鼠TA肌肉被心脏毒素损伤，36小时后，即第1.5天，向损伤部位注射dnTGFBR2逆转录病毒。第2天腓肠肌受伤，36小时后第3.5天在受伤部位注射dnTGFBR2逆转录病毒。小鼠在肌肉组织收获前12小时接受EdU IP注射。B。损伤后3天从腓肠肌分离的肌源性前体细胞进行Desmin（红色）染色，并用Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了具有代表性的图像。比例尺=50μM。C、。Desmin+前体细胞平均百分比的量化。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 0.03). 误差条表示平均值的标准误差(n个＝3个生物重复）。D。损伤后3天从腓肠肌分离的肌原前体细胞进行Desmin（红色）和EdU（绿色）染色，Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了具有代表性的图像。比例尺=50μM。E.公司。量化从接受dnTGBR2或GFP的肌肉分离的增殖肌原前体细胞的平均百分比。学生的t吨-测试（双尾）(*第页<0.02），误差条表示平均值的标准误差(n个=每组3个生物重复）F、。损伤后5天分离肌肉TA的苏木精和伊红，并在10μM的低温恒温器中切片。显示了具有代表性的图像。比例尺=100μM。G.公司。对接受dnTGFBR2或GFP逆转录病毒治疗的老年小鼠胫骨前肌损伤后5天的再生，从肌肉切片（整个损伤部位的10μM切片）进行量化，并表示为每平方毫米损伤部位新再生肌纤维的平均数。误差条表示平均值的标准误差(n个=每组3只小鼠）。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 0.01).H。用dnTGFBR2或GFP转导NPC并培养一周，然后在有/无10 ng/mL TGF-β1的生长培养基中培养16小时。细胞在固定前用EdU（30μM）脉冲处理4小时，以标记增殖细胞。用Hoechst（蓝色）标记细胞核，对细胞进行GFP或FLAG（绿色）、EdU（红色）和Sox2（灰色）染色。显示了具有代表性的图像。比例尺=100μM。一、。使用自动成像仪和MetaXpress细胞评分软件，通过对每种情况下36个随机区域的细胞评分来量化NPC的增殖。结果分别显示为EdU+Sox2+增殖NPC+/−SD的平均百分比。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 9 × 10−10**第页< 3 × 10−24, ***第页< 4 × 10−16). 误差条表示标准偏差(n个=36个技术副本）。实验重复4次。
图7
图7。TGF-β信号系统或局部减弱后神经源性和肌源性生态位中B2M水平降低
答：。qRT-PCR定量200万青年和老年海马的mRNA表达。相对平均表达水平标准化为GAPDH公司与年轻的河马有关。学生的t吨-测试（双尾）(*第页<0.04），误差条表示平均值的标准误差(n个=4岁，4岁）。B。用B2M（红色）免疫染色法对年轻小鼠（2个月龄）和Alk5抑制剂或溶媒治疗的老年小鼠（24个月龄的）海马的脑切片进行B2M免疫染色，并用Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了具有代表性的图像。比例尺=50μM。C、。使用MetaXpress软件量化平均B2M像素强度，Student’st吨-测试（双尾）(*第页< 3 × 10−6, **第页<0.0001）。误差条表示平均值的标准误差(n个=5只幼鼠，3只老鼠+Alk5i，3只老鼠+载体生物复制品（小鼠）n个=每只小鼠12次技术复制）D。损伤后5天收集的胫骨前肌进行B2M免疫染色（红色），Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了具有代表性的图像。比例尺=100μM。E.公司。使用MetaXpress软件量化损伤部位10μM胫骨前肌断面的平均B2M像素强度。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 7 × 10−7, **第页< 5 × 10−5)，误差条表示平均值的标准误差(n个=每组（小鼠）3个生物复制n个=每只小鼠12次技术复制）F、。损伤后5天收集的TA肌肉进行B2M（红色）免疫染色，用Hoechst（蓝色）标记所有细胞核。显示了具有代表性的图像。比例尺=100μM。G.公司。使用MetaXpress软件量化整个损伤部位TA肌肉切片的平均B2M像素强度。学生的t吨-测试（双尾）(*第页< 0.002). 误差条表示平均值的标准误差(n个=每组（小鼠）3个生物复制n个=每只小鼠12次技术复制）。
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