The long noncoding RNA HOTAIR has tissue and cell type-dependent effects on HOX gene expression and phenotype of urothelial cancer cells

doi:10.1186/s12943-015-0371-8

.2015年5月21日14时108分。

doi:10.1186/s12943-015-0371-8。

长非编码RNA HOTAIR对尿路上皮癌细胞HOX基因表达和表型具有组织和细胞类型依赖性影响

朱迪思·休巴赫¹, 朱莉安娜·莫西奥², 勒内·迪宁^三, Günter Niegisch公司⁴, 蒂博·萨洛斯（Tibor Szarvas）^5 6, 克里斯蒂安·尼德沃洛克⁷, 沃尔夫冈·阿瑟·舒尔茨⁸, 米歇尔·珍妮·霍夫曼⁹

附属公司

¹穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。5，40225，杜塞尔多夫，德国。judith.heubach@hhu.de。
²穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。5，40225，杜塞尔多夫，德国。juliana.monsior@hhu.de。
^三德国杜塞尔多夫大学海因里希-海因大学生物医学研究中心。1，40225，杜塞尔多夫，德国。rene.deenen@hhu.de。
⁴穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。5，40225，杜塞尔多夫，德国。Guenter.Niegisch@med.uni-duesseldorf.de。
⁵杜伊斯堡-埃森大学泌尿外科，赫芬兰德斯特。55，45147，德国埃森。sztibusz@gmail.com。
⁶匈牙利布达佩斯塞梅尔维斯大学泌尿系，邮编1082，邮编78/b。sztibusz@gmail.com。
⁷杜伊斯堡-埃森大学泌尿系，Hufelandstr。55，45147，德国埃森。Christian.Niedworok@uk-essen.de。
⁸穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。5，40225，杜塞尔多夫，德国。wolfgang.schulz@hhu.de。
⁹穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。5，40225，杜塞尔多夫，德国。米歇尔·霍夫曼@uni-duesseldorf.de。

PMID： 25994132
预防性维修识别码：项目经理4455698
内政部： 10.1186/s12943-015-0371-8

长非编码RNA HOTAIR对尿路上皮癌细胞HOX基因表达和表型具有组织和细胞类型依赖性影响

朱迪思·休巴赫等。摩尔癌症. 2015.

.2015年5月21日14时108分。

doi:10.1186/s12943-015-0371-8。

作者

朱迪思·休巴赫¹, Juliana先生², 雷内·迪宁^三, Günter Niegisch公司⁴, 蒂博·萨洛斯（Tibor Szarvas）^5 6, 克里斯蒂安·尼德沃洛克⁷, 沃尔夫冈·阿瑟·舒尔茨⁸, 米歇尔·珍妮·霍夫曼⁹

附属公司

¹穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。5，40225，杜塞尔多夫，德国。judith.heubach@hhu.de。
²穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。5，40225，杜塞尔多夫，德国。juliana.monsior@hhu.de。
^三德国杜塞尔多夫大学海因里希-海因大学生物医学研究中心。1，40225，杜塞尔多夫，德国。rene.denen@hhu.de。
⁴穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。5，40225，杜塞尔多夫，德国。Guenter.Niegisch@med.uni-duesseldorf.de。
⁵杜伊斯堡-埃森大学泌尿系，Hufelandstr。55，45147，德国埃森。sztibusz@gmail.com。
⁶匈牙利布达佩斯塞梅尔维斯大学泌尿系，邮编1082，邮编78/b。sztibusz@gmail.com。
⁷杜伊斯堡-埃森大学泌尿系，Hufelandstr。55，45147，德国埃森。Christian.Niedworok@uk-essen.de。
⁸穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。40225，德国杜塞尔多夫。wolfgang.schulz@hhu.de。
⁹穆伦斯特·海因里希·海因杜塞尔多夫大学医学院泌尿系。5，40225，杜塞尔多夫，德国。michele.hoffmann@uni-duesseldorf.de。

PMID： 25994132
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摘要

背景：尿路上皮癌（UC）是发达国家第五常见的癌症。UC分化亚型的描述突出了异常分化的重要性。了解潜在机制可能有助于诊断和制定有效的治疗策略。人们普遍认为这与表观遗传机制有关。长非编码RNA（lncRNAs）是一类新的表观遗传因子，被认为可以调节细胞类型之间的分子差异以控制细胞特性。本研究的重点是来源于HOXC基因座的lncRNA HOTIAR。它的过度表达在许多癌症中诱导侵袭性表型和同源HOX转录因子的异常表达，尤其是HOXD10，其调节分化和组织稳态。本研究的目的是确定HOTAIR在UC侵袭性表型、异常分化调节和HOX基因表达改变方面的功能作用。

方法：我们测定了UC组织和细胞系中HOTAIR和HOX基因的RNA表达水平。通过敲除HOTAIR和异位过度表达来确定对UC靶基因的影响。用HOTAIR稳定转染细胞株，以研究表型和HOX基因表达的变化。

结果：HOTAIR在大约一半的UC组织和细胞系中过度表达。HOTAIR过度表达的影响在细胞系之间存在差异。尽管VM-CUB1细胞获得了预期的表型，增殖、克隆形成性、锚定非依赖性生长、迁移活性和上皮-间充质转化增加，但5637细胞生长较慢，表现出衰老诱导和相关免疫反应基因。其他UC系表现出中间效应。根据HOTAIR过度表达的VM-CUB1细胞和5637细胞之间的表型差异，表达谱分析揭示了HOX基因、细胞周期调节器和分化的不同影响。

结论：我们的数据表明，HOTAIR过度表达可能影响UC细胞的分化状态和侵袭性，但以细胞类型依赖的方式。我们的功能研究以及我们的表达数据集与其他癌细胞类型的表达数据集的比较显示了最小的重叠，这表明HOTAIR的作用是强烈的组织依赖性的，甚至在一种癌症类型中可能有所不同。因此，HOTAIR功能和靶基因不能简单地从一种癌症类型转移到另一种癌症。

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数字

图1
HOTAIR、HOXC和HOXD基因在良性和癌性尿路上皮组织中的表达。**（a）**说明UC组织样本集1（T，n）中HOTAIR表达水平的箱线图 = 19）与正常膀胱组织相比（N，N = 10; 第页 = 0.53). 通过定量实时PCR测量表达，并将其归一化为*待定价格。*第二张图显示了UC组织中HOTAIR表达水平的范围，其中HOTAIR在三个pT3高级别肿瘤中的表达最高。**（b、c）**第1组组织中指定基因的箱线图（p值如所示；*p≤0.05，**p≤0.001）。**（d）**第二组UC组织样本的HOTAIR表达水平（第2组，n:T = 108，北纬 = 7）如箱线图（p = 0.3）以及患者之间不同的表达水平。**（e）**HOTAIR表达与*HOXC11型*,*HOXD10型*和*HOXD12型*绘制，其中“r”表示皮尔逊相关系数。黑色方块表示肿瘤样本，灰色菱形表示良性组织。

图2
HOTAIR表达和肿瘤特异性生存率的Kaplan-Meier分析。Kaplan-Meier分析显示在肿瘤特异性生存率方面有显著优势（p = 0.009），而HOTIAR表达水平最高的患者为25%。生存时间以月为单位。

图3
UC细胞中HOX基因表达和HOTAIR调节的细胞类型依赖性效应。**（a、b）**通过qRT-PCR测定UC细胞系和6种不同的正常增殖尿上皮细胞培养物（UEC；平均表达水平图示）中HOTAIR、后HOXC和HOXD基因的mRNA表达，并将其归一化为*TBP（待定）*表达水平是相对于乳腺癌细胞系MCF7显示的，MCF7被用作对照并设置为1。超出刻度的表达式值作为数值给出。为了显示MCF7细胞系中HOX基因座的活性，还分别说明了该细胞系HOXC和HOXD基因的表达水平。HOTAIR（灰柱）与*HOXD10型*在三种不同的膀胱癌细胞系中，siRNA介导HOTAIR基因敲除后，用qRT-PCR测定（黑柱）**（c）**或在来自VM-CUB1和5637细胞系的稳定克隆中HOTAIR过度表达后**（d）**.表达*HOXD10型*在VM-CUB1中，尽管HOTIAR过表达仍保持在背景水平，并且未示出。

图4
VM-CUB1细胞侵袭性表型的细胞类型依赖性诱导。**（a）**在光学显微镜下（10倍放大）观察稳定转染的VM-CUB1和5637克隆的表型变化。**（b）**E-Caddherin（顶部，绿色）和Vimentin（底部，绿色）的免疫荧光染色，以验证VM-CUB1-HOTAIR 20细胞中EMT诱导（40倍放大）。进行Transwell分析以确定迁移的变化**（c）**和入侵**（d，e）**容量（**p≤0.001). 数据来自于一次实验，每个细胞系有4个转染孔和5个视野，这些视野是随机选择的，用于计算迁移或入侵细胞的数量。重复三次试验的结果具有代表性。通过H&E染色观察侵入的细胞(d日，放大10倍）。

图5
HOTAIR过度表达对增殖和克隆形成的细胞类型依赖性影响。**（a）**用MTT法在4天内监测四倍稳定HOTAIR转染的VM-CUB1和5637细胞克隆中的活细胞相对数量。一次分析的结果代表了三次独立分析（**p≤0.001).（b）HOTAIR转染对VM-CUB1或5637细胞克隆原性的影响。**（c）**在三次软琼脂分析中，VM-CUB1_HOTAIR 20细胞非依赖于锚定生长增加的代表性图片（4倍（顶部）和20倍（中心）放大）；5637个细胞形成不良的集落，独立于HOTAIR过度表达（20x，底部）。**（d）**对额外稳定转染的VM-CUB1和5637 HOTAIR克隆进行MTT分析，结果与**（a）**在每个克隆的每个时间点测定四份活细胞数。有关p值，请参见附加文件2：表S1。**（e、f）**HOTAIR对进一步UC细胞系克隆形成的细胞类型依赖性影响（*p≤0.05, **≤0.001).

图6
RNA表达谱分析结果揭示了HOTAIR的细胞类型依赖性靶基因。**（a）**VM-CUB1_HOTAIR 20和5637_HOTAIR 4细胞中差异表达基因的文氏图，与各自的载体对照进行比较。将每个克隆的三个独立RNA制备物与Affymetrix PrimeView 3′IVT阵列杂交。具有p显著性的差异表达基因 < 0.01（Benjamini-Hochberg调整）。**（b）**VM-CUB1和5637中至少有两倍过度表达的基因（p < 0.01）使用DAVID分析软件进行GO分析。GO生物过程术语在p显著富集 < 考虑调整后0.05；该列表是为多个类似术语编辑的。**（c）**稳定转染VM-CUB1和5637细胞中HOX基因表达模式的变化（p < 0.01）显示为热图。下调基因用浅灰色方框表示，上调基因用深灰色方框表示。HOX基因没有显著变化，显示为白色。

图7
ChIP和qRT-PCR对HOX基因异常表达的机制研究。**（a）**的差异表达*HOXA11型*在VM-CUB1和5637个HOTAIR克隆中，通过相对于TBP的qRT-PCR进行验证（左图）。使用ChIP和随后的qPCR来确定H3K4、H3K9和H3K27三甲基化的变化，与VM-CUB1细胞（中）和5637细胞（右）的IgG对照相比。类似分析*HOXB2型* **（b）**,*HOXC6型* **（c）**和*HOXD10型* **（d）**.多梳组蛋白EZH2的过度表达(**e（电子）**，85 kDa）和SUZ12(**（f）**，83 kDa）在UC细胞中的RNA（左侧）和蛋白质水平（右侧）。检测管蛋白（50 kDa）作为负荷对照。

图8
HOTAIR靶基因具有高度组织特异性。**（a）**Gupta等人[15]公开发表的ChIP数据用于选择674个基因，这些基因在MDA-MB-231乳腺癌细胞中异位表达HOTAIR后，在启动子处获得H3K27三甲基化增加。这些基因与HOTAIR稳定异位表达后两种UC细胞系中下调的784个基因相匹配（p < 0.01).（b）食管癌细胞系KYSE180[21]和两个UC细胞系VM-CUB1和5637中差异表达HOTAIR靶基因的文氏图（p < 0.01），说明了HOTIAR调节的基因在两种癌症类型之间的最小重叠。

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