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.2015年5月18日；10（5）：e0127058。
doi:10.1371/journal.pone.0127058。 2015年电子收集。

HDAC抑制剂Scriptaid和LBH589联合溶瘤病毒Delta24-RGD增强患者源性胶质母细胞瘤细胞的抗肿瘤效力

Lotte M E Berghauser桥 1, 安妮·克莱恩 1, Jenneke J Kloezeman公司 1, 沃特·范登·博斯克（Wouter van den Bossche） 1, 约翰娜·考夫曼 2, 杰罗恩·德弗里吉 3, Sieger Leenstra公司 4, 克莱门斯·M·F·迪文 1, Martine L M Lamfers公司 1
附属公司

HDAC抑制剂Scriptaid和LBH589联合溶瘤病毒Delta24-RGD增强患者源性胶质母细胞瘤细胞的抗肿瘤效力

Lotte M E Berghauser桥等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：最近完成了用溶瘤腺病毒Delta24-RGD治疗胶质母细胞瘤的I/II期试验。Delta24-RGD在视网膜母细胞瘤受损的细胞中有条件地复制，并通过αvβ3/5整合素进入细胞。胶质母细胞瘤对Delta24-RGD的敏感性不同。HDAC抑制剂（HDACi）影响整合素并与Delta24-RGD共享共同的细胞死亡途径。我们研究了HDACi和Delta24-RGD对患者源性胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的联合治疗效果，并确定了最有效的HDACi。

方法：SAHA、丙戊酸、Scriptaid、MS275和LBH589在14个不同的GSC中与Delta24-RGD结合。协同作用用Chou-Talalay法测定。使用荧光素酶和GFP编码载体以及六角形滴定法评估病毒感染和复制。流式细胞术检测柯萨奇腺病毒受体和αvβ3整合素水平。通过活性、caspase-3/7、LDH和LC3B/p62、磷酸化p70S6K研究肿瘤溶解和细胞死亡机制。对正常人星形胶质细胞进行了毒性研究。MGMT启动子甲基化状态、TCGA分类、Rb通路和整合素基因表达水平被评估为反应性标记。

结果：Scriptaid和LBH589在大约50%的GSC中与Delta24-RGD协同作用。这两种药物都适度增加了有反应的GSC中αvβ3整合素水平和病毒感染，但无反应的GSCs中没有。LBH589适度增加了晚期病毒基因的表达，然而，病毒滴定显示HDACi、Scriptaid增强的caspase-3/7活性、LC3B转化、p62和磷酸化p70S6K消耗以及LDH水平均降低了病毒子代的产生。LBH589增加了LDH和磷-70S6K的摄入。反应性与各种Rb通路基因和整合素的表达相关。联合治疗对人类星形胶质细胞的毒性有限。

结论：LBH589和Scriptaid与Delta24-RGD联合显示GSC亚群具有协同抗肿瘤活性。HDACi均适度增加了病毒感染和晚期基因表达，但略微降低了子代产量。这些药物不同地激活了多种细胞死亡途径。对星形胶质细胞的有限毒性支持了对提议的联合疗法的进一步评估。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。Delta24-RGD与患者源性GSC培养中的各种HDACi相结合。
（A-E）分别按照HDACi和Delta24-RGD在指定浓度和MOI下的同时治疗方案治疗的八种患者源性GSC培养物。这些处理同时添加到细胞中。显示了Scriptaid（A）、LBH589（B）、SAHA（C）、VPA（D）和MS275（E）的一剂药物和一剂溶瘤病毒的结果。反应被定义为生存能力的降低，这与两种单药治疗有显著差异（p<0.05），并且在图中用蓝色条表示（反应者）。如果不符合这些标准，则该培养物被定义为耐药（红条）。结果显示为三倍的平均生存率%±标准偏差*与HDACi或Delta24-RGD单独治疗相比，表明联合治疗的显著性，p<0.05。
图2
图2。Scriptaid和LBH589与患者源性GSC培养物中的Delta24-RGD溶瘤协同作用。
（A） 对Scriptaid（μM）和Delta24-RGD（MOI）进行Chou-Talalay分析，以确定GSCs GS102、GS224和GS289中的协同作用。这些处理是与细胞一起加入的。结果被描述为三个重复的活菌分数（0-100），与未处理对照组相比±标准偏差*表明联合用药和单药治疗之间存在显著差异（p<0.05）。（B） 对LBH589（nM）和Delta24-RGD（MOI）进行Chou-Talalay分析，以确定应答GSCs GS102、GS224和GS289中的协同作用。这些处理同时添加到细胞中。结果被描述为与三个重复的未处理对照组相比的活菌分数±标准偏差*表明联合用药和单药治疗之间存在显著差异（p<0.05）。（C） 根据GSC计算药物和Delta24-RGD的组合指数（CI），并在同一图表中显示。CI<1表示两种药剂之间的协同作用。
图3
图3。增加广告收入。HDACi治疗应答患者源性GSC培养中RGD感染和整合素水平。
（A） 用LBH589（LBH，15nM）或Scriptaid（Scr，1.5μM）处理应答性GSC培养物（蓝色，GS102，GS224和GS289）和耐药培养物（红色，GS79，GS245和GS249），并同时感染荧光素酶表达载体Ad.luc。RGD公司。感染24小时后测量荧光素酶的表达。结果显示为相对荧光素酶单位（RLU）/100μL裂解物*表明联合治疗与单纯病毒治疗相比的显著性（p<0.05）。（B） 如图所示，用LBH589（蓝色）和Scriptaid（红色）处理三个应答者（左侧，GS102、GS224和GS289）和两个无应答者（右侧，GS79和GS245）的细胞。6小时（图S3）和24小时（如图所示）后，收集细胞，并通过流式细胞术分析测定整合素αvβ3（左）和CAR（右）水平。
图4
图4。HDACi对病毒转基因表达、复制和生产的影响。
（A） 用LBH589或Scriptaid和Delta24-RGD-GFP病毒同时处理GS 102、GS224和GS289细胞。在延时中，每毫米的荧光强度2分别使用IncuCyte系统和Image J测量和分析每个孔的计数。结果以平均值±标准偏差的形式绘制*表明与单独使用Delta24-RGD相比，联合治疗的显著性（p<0.05）。（B） 96小时时，孵化器系统获得的代表性荧光图像显示为GS102、GS224和GS289（放大10倍）。（C） 同时用Delta24-RGD和LBH589或Scriptaid处理应答性GSC GS102和GS224细胞（蓝色）以及非应答性GSC-培养物GS79和GS245细胞（红色）。显示了处理后48小时和96小时获得的细胞提取物中的病毒滴度*与HDACi和Delta24-RGD联合治疗相比，单独使用Delta24-RGD的病毒滴度有显著差异（p<0.05）。
图5
图5。HDACi/Delta24-RGD治疗中受影响的细胞死亡机制。
（A） 同时用HDACi和Delta24-RGD处理GS102、GS224和GS289细胞。使用Caspase-3/7凋亡分析测定Caspase-3/4活性，并显示IncuCyte系统和计数/孔*表明单次治疗与非治疗对照组相比显著性为p<0.05±标准偏差；与对照组（**）和两个单药治疗组（***）相比，**/***表示联合治疗组的显著性（p<0.05）。（B） 同时用HDACi和Delta24-RGD处理GS102细胞。72小时后，收集细胞，通过Western blot分析测定LC3BI/II、p62和磷酸化p70SK水平。β-肌动蛋白被检测为负荷控制。（C） GS102、GS224和GS289细胞同时用Scriptaid（上面板，灰色）或LBH589（下面板，白色）和Delta24-RGD处理。在治疗后五天，使用CytoTox-One分析试剂测定LDH水平。使用帝肯读数器测量荧光。LDH水平表示为未经处理的对照组的百分比±标准偏差，并根据生存能力进行了校正。*与对照组（**）和两个单药治疗组（***）相比，联合治疗组的显著性为p<0.05。
图6
图6。HDACi/Delta24-RGD对正常人星形胶质细胞的影响。
（A） 正常人星形胶质细胞同时接受一定剂量范围的HDACi和Delta24-RGD治疗，并使用IncuCyte成像系统监测形态学变化。描述了第五天测试条件下的代表性图像（放大10倍）。（B） 使用CellTiter-Glo分析在治疗后第五天测量细胞的存活率，结果显示为未处理对照细胞的百分比±标准偏差*与未经处理的对照细胞相比，经处理的细胞在p<0.05时具有显著性。
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