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.2015年12月；22(12):2087-97.
doi:10.1038/cdd.2015.58。 Epub 2015年5月15日。

肠道病毒蛋白酶对TDP-43的细胞质易位、聚集和裂解调节病毒发病机制

G Fung公司 1, J Shi先生 1, H邓 1, 侯俊杰 1 2, C王 1, A Hong公司 1, J张 1, W Jia女士 三, H罗 1
附属公司

肠道病毒蛋白酶对TDP-43的细胞质易位、聚集和裂解调节病毒发病机制

G Fung公司等。 细胞死亡不同. 2015年12月.

摘要

我们之前已经证明，柯萨奇病毒B3（CVB3）是一种阳性标记的RNA肠道病毒，感染后会导致不溶性泛素蛋白聚集体的积累，这类似于神经退行性疾病的常见特征。蛋白质聚集在病毒发病机制中的重要性已被认识；然而，潜在的监管机制仍不明确。反式反应DNA-结合蛋白-43（TDP-43）是一种RNA-结合蛋白质，在多水平调节RNA代谢中起重要作用。TDP-43的裂解和细胞质聚集是肌萎缩侧索硬化和额颞叶退行性变的主要分子标记物，对疾病进展有重要作用。在本研究中，我们报道了在CVB3感染期间，TDP-43通过病毒蛋白酶2A的活性从细胞核转移到细胞质，然后通过病毒蛋白酶3C介导的切割。TDP-43的细胞质易位伴随着溶解度降低和蛋白质聚集体形成增加。谷氨酰胺和丙氨酸在氨基酸327处发生裂解，产生的N端和C端裂解片段分别为~35kDa和~8kDa。TDP-43的C末端产物不稳定，通过蛋白酶体降解途径快速降解，而TDP-43 N末端截短作为一个显性负突变体，抑制天然TDP-43在选择性RNA剪接中的功能。最后，我们证明了TDP-43的敲除导致病毒滴度的增加，这表明TDP-43在CVB3感染中具有保护作用。综上所述，我们的研究结果提出了一个新的模型，通过该模型，CVB3感染导致的TDP-43的细胞质重新分布和分裂会破坏TDP-43溶解度和转录活性。我们的结果还揭示了肠道病毒进化出的支持高效病毒感染的机制。

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图1
图1
CVB3感染后TDP-43被裂解。(一)CVB3感染9天后A/J小鼠心脏中TDP-43的表达。使用抗N末端TDP-43抗体对心脏提取物进行处理，以进行TDP-43蛋白表达的western blot分析。GAPDH水平作为蛋白质负荷对照进行检测。(b条和c（c）)TDP-43蛋白在小鼠原代心肌细胞中的表达(b条)和HeLa细胞(c（c）)感染CVB3的多重感染率（MOI）分别为100和10，持续不同时间，如图所示。如上所述进行Western blot分析以检测TDP-43、病毒衣壳蛋白VP1和β-actin（加载控制）。(d日)CVB3感染后TDP-43的裂解。用表达HA-TDP-43-GFP的质粒瞬时转染HeLa细胞，然后用7 CVB3感染h。收集细胞并使用抗HA抗体进行western blotting处理，以检测外源性TDP-43。*指示约35处的分裂TDP-43带 kDa。cp，裂解产物。使用NIH ImageJ通过密度计分析对前和裂解的TDP-43的蛋白质水平进行定量，标准化为GAPDH或β-肌动蛋白，并出现在每个印迹的下方
图2
图2
TDP-43被病毒蛋白酶3C切割。(一和b条)病毒蛋白酶3C裂解TDP-43。(一)HeLa细胞裂解物（50 μg） 用或不用病毒蛋白酶3C（0.1 μg） 用于所示的不同时间。(b条)瞬时表达HA-TDP-43-GFP的HeLa细胞的蛋白提取物与野生型或催化失活的3C（3C）突变体孵育多用途终端)用于16 小时。体外按照“材料和方法”中的说明进行切割试验。使用抗N末端TDP-43检测TDP-43的表达(一)或抗HA抗体(b条). (c（c）–e（电子）)一般caspase抑制对CVB3介导的TDP-43裂解的影响。HeLa细胞感染CVB3 7 小时(c（c）)或9 小时(e（电子）)存在或不存在Z-VAD-FMK（zVAD，50 μM） ●●●●。使用抗N末端TDP-43抗体进行Western blotting检测TDP-43的表达，并使用抗caspase-3抗体检测caspase-3的裂解(d日). VP1和β-肌动蛋白检测如上所述。*指示约35处的分裂TDP-43带 kDa.“-”，车辆控制（用二甲基亚砜处理）。密度分析如图1所示
图3
图3
TDP-43在Q327被劈开。(一)瞬时转染HA-TDP-43-GFP（WT）或HA-TDP-4 3的HeLa细胞Q327升-GFP（Q327L）为假阳性或CVB3感染7 h.收集细胞，使用抗HA抗体VP1和β-肌动蛋白。密度分析如图1所示。(b条)瞬时表达WT或HA-TDP-43的HeLa细胞的50微克蛋白质提取物Q327升-GFP与增加浓度的病毒蛋白酶3C或2A孵育，如8所示 h.使用CVB3感染的HeLa裂解物作为对照，以比较类似的35 kDa解理碎片。TDP-43、VP1和β-如上所述检测到肌动蛋白。*指示约35处的分裂TDP-43带 kDa。(c（c）)TDP-43的功能域、确定的解理位点和由此产生的解理片段的示意图。RRM，RNA再认识基序；NLS，核定位信号；和NES，核出口信号
图4
图4
病毒蛋白酶2A负责CVB3感染期间TDP-43的细胞质重定位和聚集。(一)CVB3感染后TDP-43的细胞质重新分布和聚集。短暂共表达HA-TDP-43-mCherry和EGFP-G3BP1的HeLa细胞被假感染或CVB3感染3 h.显示共焦荧光图像（TDP-43，红色；G3BP1，绿色；细胞核，DAPI（蓝色））。按照“材料和方法”中的描述，在10幅不同的图像上对表达细胞质TDP-43的细胞百分比进行量化(b条)病毒蛋白酶表达后TDP-43的定位。用HA-TDP-43-GFP和病毒蛋白酶2A、3C或空载体瞬时共转染HeLa细胞24小时 h.使用抗HA抗体（Alexa-fluro-594，红色）进行免疫染色以检测TDP-43。细胞核用DAPI（蓝色）复染。右侧显示了10幅不同图像中表达细胞质TDP-43的TDP-43阳性细胞的百分比
图5
图5
TDP-43在感染CVB3的细胞中的溶解度降低。HeLa细胞感染CVB3 7 h、 收集细胞裂解物，并使用RIPA和尿素缓冲液依次提取蛋白质。使用抗N-末端TDP-43抗体进行蛋白质印迹，以检测全长和N-末端裂解形式的TDP-43。检测GAPDH的表达以评估蛋白质提取的纯度（GAPDH以RIPA-可溶部分表示）并作为负荷控制。*表示N个-TDP-43的末端片段。RIPA-S，RIPA缓冲区可解决；RIPA-I、RIPA缓冲液不溶。密度分析如图1所示
图6
图6
CVB3感染后TDP-43-C通过蛋白酶体途径迅速降解，TDP-43-N定位于应激颗粒形成蛋白质聚集体。(一)全长型和截短型TDP-43的蛋白表达。如图所示，用HA-TDP-43-GFP、HA-TDP-4 3-N或HA-TDP-43-C瞬时转染HeLa细胞。使用抗HA抗体检测各种类型的TDP3的蛋白质表达。的级别β-肌动蛋白被检测为负荷控制。(b条)TDP-43-C通过蛋白酶体途径降解。在200存在下用HA-TDP-43-C瞬时转染HeLa细胞 nM巴非霉素（溶酶体抑制剂），1 μM MG132（蛋白酶体抑制剂）或同等体积的DMSO作为24小时的载体对照 h.使用检测内源性TDP-43（~43）的抗C末端TDP-43抗体进行蛋白质印迹 kDa）和外源性HA-TDP-43-C（~8 kDa）。如图1所示，对TDP-43轮廓、TDP-43-N和TDP-43-C进行密度分析。(c（c）)CVB3感染或病毒蛋白酶2A表达后TDP-43-N的细胞质定位和聚集。用HA-TDP-43-N和EGFP-G3BP1瞬时共转染HeLa细胞24小时 h、 随后CVB3感染3次 h或第二轮转染病毒蛋白酶2A，如图所示。使用抗HA抗体（Alexa-fluro-594，红色）进行免疫染色以检测TDP-43-N。细胞核用DAPI（蓝色）复染。EGFP-G3BP1的GFP信号显示为绿色。表达细胞质TDP-43的细胞百分比如图4所示进行量化
图7
图7
TDP-43-N破坏了中本地TDP-43的功能CFTR公司拼接。HeLa细胞瞬时联合转染CFTR公司报告构建物（TG（13）T（5）），带有空载体控制、全长TDP-43或24小时TDP-43-N h.提取RNA并进行RT-PCR检测CFTR公司外显子9跳跃。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上显示（上面板），并通过NIH imageJ软件进行量化，并以剪接外显子9与未剪接外隐子9的比率表示（平均值±S.D。，n个=3; 下部面板）**P（P）<0.01. 箭头表示之前记录的拼接变体。外显子9包含（+）和排除（−）如图所示
图8
图8
敲除TDP-43可增强CVB3复制。用靶向TDP-43（siTDP-43）的siRNA或干扰siRNA（siCon）转染HeLa细胞48 h后CVB3感染16 感染多重性（MOI）为1。(一)进行蛋白质印迹以检测TDP-43和β-actin（加载控制）。密度分析如图1所示。*表示TDP-43的N-末端切割片段。(b条)进行菌斑试验以评估上清液中的病毒滴度。病毒滴度以每毫升斑块形成单位（pfu）表示，并以平均值±S表示。D(n个＝3）*P（P）<0.05. (c（c）)TDP-43和dsRNA在CVB3感染细胞细胞质中的定位。用HA-TDP-43转染HeLa细胞24小时 h、 其次是CVB3感染3 h.使用抗HA抗体（绿色）进行免疫染色以检测TDP-43，使用抗dsRNA抗体（红色）进行dsRNA检测。细胞核用DAPI（蓝色）复染。皮尔逊相关系数（PCC）是使用Volocity软件5.2.1版对至少三张图像进行计算的
图9
图9
提出了CVB3调控TDP-43通路的模型。核TDP-43参与正常条件下RNA代谢的调节。CVB3感染后，病毒蛋白酶2A导致TDP-43从细胞核转移到细胞质(一)其中，TDP-43在氨基酸Q327处被病毒蛋白酶3C裂解，生成TDP-43-N和TDP-43-C(b条). 细胞质全长TDP-43和TDP-43-N的溶解度降低，易于聚集(c（c）). TDP-43-C通过蛋白酶体降解途径快速降解，导致其功能丧失(d日)，而TDP-43-N是一个显性负突变体，它抑制了TDP-43在RNA剪接中的生物活性(e（电子）)
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