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.2015年5月15日;142(10):1885-92.
doi:10.1242/dev.115253。

一种腺相关病毒变体增强体内神经干细胞的选择性基因传递

附属公司

一种腺相关病毒变体增强体内神经干细胞的选择性基因传递

梅丽莎·科特曼等。 开发. .

摘要

神经干细胞(NSC)的定义是其自我更新和分化为成熟神经元和胶质细胞类型的能力。由于神经干细胞在神经发育和成人大脑功能中的关键作用,以及由于它们为损伤或疾病后的基因和细胞替代疗法提供了潜在的靶点,因此它们是深入研究的对象。专门从基因上干扰或调节神经干细胞功能的方法对任何一种动机都是有价值的。不幸的是,大多数基因传递载体无法在体内高效或特异地向神经干细胞传递基因。基于腺相关病毒(AAV)的载体具有许多优点,并已在临床试验中证明越来越成功。然而,天然AAV变体在转化NSC方面效率低下。我们之前设计了一种新的AAV变体(AAV r3.45),能够在体外高效转导成年NSC。在这里,为了建立在这个变种最初的希望之上,我们研究了它的体外和体内感染性。在含有包括神经干细胞和神经元在内的混合细胞类型的人类胚胎干细胞衍生培养物中,AAV r3.45对神经干细胞的选择性高于成熟神经元。经颅内载体给药后,与天然AAV血清型相比,它能够更有效和选择性地在体内转导大鼠和小鼠NSC。成分活性β-catenin的传递使我们深入了解了该关键调节因子调节NSC功能的机制,这表明该工程化AAV变体可用于海马中成年NSC的优先调节。快速基因改造这些细胞的能力可能会大大加快成人神经发生的体内研究。

关键词:腺相关病毒;基因传递;神经干细胞。

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数字

图1。
图1。
对hESC衍生NSC的选择性在体外.(A) 含有神经干和祖细胞(顶行,红色)或成熟神经元(底行,红色h感染表达GFP(绿色)的重组AAV2、AAV6或AAV r3.45载体后。每种类型的感染细胞的代表性示例用箭头标记。比例尺:100微米。(B) GFP百分比+对巢蛋白或MAP2B的细胞共染色进行定量,以确定每个病毒载体的选择性。误差线表示s.d(n个=3); *P(P)<0.01**P(P)<0.005(方差分析)。
图2。
图2。
大鼠脑中成年神经干细胞的选择性和传染性。(A) 注射表达GFP的重组AAV2、AAV4、AAV6或AAV r3.45载体后3周,大鼠齿状回的低(主,20倍)和高(插图,100倍)放大率下的代表性图像(绿色)。脑切片与DAPI(蓝色)共同染色,以确定巢蛋白(顶行,红色)或NeuN(底行,红色。虚线矩形表示插图中放大的区域。比例尺:100微米。(B) 感染AAV r3.45载体的1型NSC的代表性图像。(C) GFP百分比+对每种细胞类型的标记物进行细胞共染色定量,以确定每种病毒载体的选择性。(D) 嵌套百分比+/Gfap公司+(类型1)或嵌套+/Sox2系统+对每种病毒载体感染的(2a型)细胞进行量化,以确定NSC的传染性。误差线表示s.d(n个=3); *P(P)<0.05, **P(P)<0.01, ***P(P)<0.005(方差分析)。
图3。
图3。
小鼠脑中成体神经干细胞的选择性和传染性。(A) 注射表达GFP(绿色)的重组AAV2、AAV6或AAV r3.45载体3周后,小鼠齿状回低倍(主,20倍)和高倍(插入,100倍)放大的代表性图像。脑切片与DAPI(蓝色)共同染色,以确定巢蛋白(顶行,红色)或NeuN(底行,红色。虚线矩形表示插图中以高倍显示的区域。比例尺:100微米。(B) GFP百分比+对每种细胞类型的标记物进行细胞共染色定量,以确定每种病毒载体的选择性。(C) GFP百分比+对NeuN(神经元标记物)或NeuN和BrdU(细胞分裂标记物)的细胞共染色进行分析,以确定GFP的比例+在处死前与感染的神经干细胞分化的神经元。(D) GFP百分比+在注射后3、7和14天,对每种细胞类型标记物的细胞共染色进行量化,以确定变异AAV r3.45的选择性。(E) 嵌套百分比+/Sox2系统+对每个病毒载体感染的(2a型)细胞进行量化,以确定NSC的传染性。误差线表示s.d(n个=3); **P(P)<0.005时***P(P)<0.001(方差分析)。
图4。
图4。
CAβ-catenin诱导神经干细胞增殖和分化。(A,B)注射表达(A)GFP(绿色)或(B)CAβ-catenin-2×FLAG(绿色)的重组AAV r3.45载体3周后,小鼠齿状回的低(20倍)放大率代表性图像。脑切片共染NeuN(蓝色)和EdU(红色),感染细胞共染Neu和EdU用箭头标记。比例尺:100微米。(C) 感染细胞(FLAG+,β-catenin条件;GFP公司+分析EdU(细胞分裂标记)、nestin(NSC标记)、Dcx(未成熟神经元标记)和/或NeuN(神经元标记)的共染色,以确定β-catenin刺激NSC增殖和分化的程度。误差线表示s.d(n个=3); *P(P)<0.001(方差分析)。

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