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.2015年7月；35（14）：2479-94。
doi:10.1128/MCB.00125-15。 Epub 2015年5月11日。

溶酶体膜蛋白SLC38A9对氨基酸依赖性mTORC1的调节

詹妮弗·荣格 1, 海德·玛丽卡·杰诺 1, 克里斯蒂安·贝伦兹 2
附属公司

溶酶体膜蛋白SLC38A9对氨基酸依赖性mTORC1的调节

詹妮弗·荣格等。 分子细胞生物学. 2015年7月.

摘要

丝氨酸/苏氨酸激酶mTORC1根据营养状态和能量水平等多种线索调节细胞内稳态。氨基酸通过小Rag GTPases和Ragulator复合体在溶酶体上诱导mTORC1激活，从而控制蛋白质翻译和细胞生长。在这里，我们确定人类11通路跨膜蛋白SLC38A9是Rag-Ragulator复合物的一种新成分。SLC38A9与溶酶体上的Rag-Raulator复合物组分定位，并以氨基酸敏感和核苷酸结合状态依赖的方式与Rag GTP酶结合。在存在氨基酸的情况下，SLC38A9的耗尽会抑制mTORC1活性，并对饥饿后的氨基酸补充作出反应。相反，SLC38A9过度表达导致RHEB（脑中富含Ras同源物）GTPase依赖性mTORC1过度激活，并在氨基酸缺失时部分维持mTORC2活性。有趣的是，在氨基酸饥饿期间，当SLC38A9耗尽时，mTOR保留在溶酶体中，但未能被激活。总之，我们的研究结果表明SLC38A9是Rag-Ragulator复合物成员，可将氨基酸转化为mTORC1活性。

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数字

图1
图1
调节性mTORC1组分的相互作用蛋白质组学。通过IP-MS分析12种诱饵（包括Rag GTPases（A）、所有Ragulator亚基（B）和TSC（C）及其高置信度候选相互作用蛋白（HCIP））获得的分组相互作用网络方案；平均APSM≥3和WDN个得分≥1）。所有相互作用都根据功能群（红色，mTORC1；蓝色，Ragulator；绿色，Rag蛋白质；橙色，TSC；黑色，SLC38A9）进行了彩色编码。线条粗细表示与WD的相互作用N个得分在1到10之间。指示用MCLB NP-40（实线）或MCLB CHAPS（虚线）缓冲液的差异裂解。完整的蛋白质组数据见补充材料中的表S1A和B以及图S1。
图2
图2
SLC38A9与Rag-Ragulator复合物相关。（A） 通过IP-MS分析14种毒饵（包括猛禽、TSC、LAMTOR1-5和Rag GTPases以及SLC38A9）获得的调节性mTORC1相互作用网络概述。功能组和裂解缓冲液的编码如图1图例所示。SLC38A9 HCIP采用黑色镶边进行标记。与全长SLC38A9或其N末端片段（aa 1至119）的相互作用分别以黑色和灰色表示。提供了SLC38A9的域结构示意图。完整的蛋白质组数据见补充材料中的表S1A和B以及图S1。（B） 293T-REx细胞诱导表达Rag-Ragulator复合物或TSC2的HA标记成分，用GFP-SLC38A9转染或保留未转染（模拟）。NP-40细胞裂解物用所示的抗GFP或抗HA珠进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析。*，IgG重链。（C和D）293T细胞用HEPES缓冲液溶解，然后用抗SLC38A9、抗RRAGC或抗myc作为对照进行免疫沉淀。共免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE分离并通过免疫印迹（C）分析，或进行凝胶内胰蛋白酶消化和质谱分析（D）。肽的数量显示为每种蛋白质0到15个肽。免疫沉淀诱饵蛋白用红边标记。完整的蛋白质组数据见补充材料中的表S1C。
图3
图3
SLC38A9的胞浆N末端介导与Rag-Raulator复合物的结合。将GFP-SLC38A9全长、GFP-SLC38A9 aa 1至119或GFP单独转染293T-REx细胞，诱导表达所示HA标记的Rag或LAMTOR蛋白。NP-40细胞裂解物用抗GFP微球进行免疫沉淀，用SDS-PAGE和免疫印迹法检测共免疫沉淀蛋白。
图4
图4
SLC38A9定位于溶酶体。（A） 将转染GFP-SLC38A9全长或GFP-SLC38A9 aa 1至119的293T细胞固定并用抗LAMP2抗体染色。比例尺，10μm。皮尔逊相关系数(R（右）)沿ImageJ中的一条线测量叠加图像的不同通道中的像素强度后，在Excel中计算。A.U.，任意单位。（B） 将转染非靶向对照（sicon）或SLC38A9 siRNA的293T细胞固定，并用抗SLC38A 9和抗LAMP2抗体标记。比例尺，10μm。R（右）按照面板A所述进行计算。
图5
图5
SLC38A9与Rag-Ragulator复合物的氨基酸依赖性共定位。用对照（sicon）或SLC38A9 siRNA转染诱导表达Rag-Ragulator复合物HA标记成分的293T或293T-REx细胞。在用抗-HA或抗-LAMP2和抗-SLC38A9抗体固定和标记之前，将细胞培养在完全RPMI生长培养基（fed）或缺氨基酸培养基中50分钟。比例尺，10μm。在ImageJ中沿一条线测量叠加图像的不同通道中的像素强度，以及皮尔逊相关系数(R（右）)在Excel中计算。
图6
图6
SLC38A9与Rag GTPases的结合依赖于氨基酸和核苷酸。（A） 将GFP-SLC38A9全长、GFP-SLC38A9 aa 1至119或GFP单独转染293T-REx细胞，诱导表达HA标记的Rag GTPase蛋白。细胞要么在完全RPMI生长培养基（喂食）中生长50分钟，要么氨基酸（aa）缺乏，随后用MCLB NP-40裂解以进行GFP免疫沉淀。用SDS-PAGE和免疫印迹法分析免疫沉淀物。（B） 如图所示，用非靶向对照（sicon）或SLC38A9 siRNAs和myc-tagged LAMTOR2以及野生型（RRAGB野生型[RB-wt]、RRAGC野生型[RC wt]和RRAGA野生型[RA wt]）或突变型（RRAGB Q99L[RB-QL]、RRAGB T75L[RB-TL]、RRACC Q120L[RC QL]、RRAGC S54L[RC SL]）HA-taged Rag GTPase蛋白转染293T细胞。在HEPES缓冲液中溶解细胞，进行HA-免疫沉淀，并如上所述进行分析。（C） 如图所示，用对照（sicon）或SLC38A9 siRNA转染诱导表达HA标记的RRAGC、LAMTOR1或Raptor（标记有红边）的293T-REx细胞，然后在MCLB CHAPS缓冲液中裂解并用HA珠免疫沉淀。用MS分析洗脱液。肽的数量显示为每种蛋白质0到100个肽。完整的蛋白质组数据见补充材料中的表S1D。（D） 在HEPES缓冲液中溶解类似于C组的细胞，然后进行免疫沉淀、SDS-PAGE和免疫印迹。（E） 如面板C所述转染猛禽过表达293T-REx细胞，在MCLB CHAPS缓冲液中裂解，并按面板D所述分析。
图7
图7
SLC38A9调节mTORC1活性。用不同的非靶向对照（sicon）或SLC38A9 siRNA转染（A和B）293T细胞，如图所示。细胞裂解物进行SDS-PAGE和免疫印迹。使用磷酸特异性抗体测定S6K（A）、ULK1（A）和4EBP1（A和B）的磷酸化状态。PCNA用作装载控制。exp.，暴露。（C） 此外，通过RT-qPCR证实了面板A和B中SLC38A9的敲除。几何，几何手段。（D） 将HA-SLC38A9全长、HA-SLC38 A9 aa 1至119或空载体转染293T细胞。转染48小时后，对细胞进行裂解，并使用磷酸特异性抗体测定mTORC1底物的磷酸化状态。PCNA用作装载控制。（E） 以Torin1（1 h，250 nM）或二甲基亚砜（DMSO）作为对照，并按照D组所述进行分析。（F）分别用HA-SLC38A9全长或空载体转染稳定shRNA-介导的RHEB GTPase缺失或对照293T细胞，然后进行SDS-PAGE和免疫印迹。通过测定S6K的磷酸化状态来评估mTORC1活性。（G） RT-qPCR证实了面板F中显示的RHEB GTPase敲除。
图8
图8
SLC38A9根据氨基酸可用性调节mTORC1活性。（A和B）用非靶向对照（sicon）或SLC38A9 siRNA转染后72小时，用CHX（2小时，2μg/ml）或DMSO作为对照（A）处理293T细胞，或喂食或饥饿氨基酸50分钟（B），如图所示。将细胞裂解物与所示抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹。PCNA作为装载控制。（C） 将来自用HA-SLC38A9或空载体转染的293T细胞的裂解物喂食或氨基酸饥饿50分钟，并用所指示的抗体通过免疫印迹进行分析。PCNA用作装载控制。（D） 将转染非靶向对照（sicon）或SLC38A9 siRNA的293T细胞进行氨基酸饥饿50分钟或氨基酸饥饿50 min，然后用指定的氨基酸补充10分钟。使用磷酸特异性抗体测定ULK1的磷酸化状态。PCNA作为装载控制。星号表示非特定带。
图9
图9
SLC38A9缺失影响mTOR从溶酶体到胞浆的重新定位。用非靶向对照（sicon）或SLC38A9 siRNA转染的（A至D）293T细胞被固定，并用抗mTOR和抗LAMP2抗体标记。比例尺，10μm。（A） 示例图像。至少40000个mTOR（B和C）和LAMP2（D）阳性点的量化(n个=4）（B），110000(n个=5）（C），或19000(n个=3）（D）个细胞。sicon/fed标准，fed条件下标准化为sicon。数据表示平均值±SEM，并使用GraphPad Prism进行统计分析。通过双向方差分析和Bonferroni的事后检验（*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001). （E） 用非靶向对照（sicon）或SLC38A9 siRNA转染293T细胞。转染72小时后，裂解细胞并用SDS-PAGE和免疫印迹分析LAMP2蛋白水平。PCNA用作装载控制。（F） SLC38A9通过依赖于细胞氨基酸状态的N末端细胞溶质域与Rag-Ragulator复合物相互作用，从而调节氨基酸依赖的mTOR定位和mTORC1活性。
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中的注释

  • 对MTORC1氨基酸传感和激活的新见解。
    Gatica D、Klinsky DJ。 Gatica D等人。 生物靶标。2017年5月；1:2. doi:10.21037/biotarget.2017.04.01。Epub 2017年5月16日。 生物靶标。2017 PMID：30159546 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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    1. Kim DH、Sarbassov DD、Ali SM、Latek RR、Guntur KV、Erdjument-Bromage H、Tempst P、Sabatini DM，2003年。GbetaL是猛禽和mTOR之间营养敏感相互作用所需的雷帕霉素敏感途径的正调控因子。分子细胞11:895–904。doi:10.1016/S1097-2765（03）00114-X。-内政部-公共医学
    1. Sengupta S，Peterson TR，Sabatini DM，2010年。营养素、生长因子和应激对mTOR复合物1途径的调节。分子细胞40:310–322。doi:10.1016/j.molcel.2010.09.026。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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