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.2015年5月1日;21(9):2167-76.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-1826。

白细胞介素2诱导的T细胞激酶,一种治疗黑色素瘤的新靶点

附属公司

IL2诱导的T细胞激酶——黑色素瘤新的治疗靶点

克雷格·卡森等。 临床癌症研究. .

摘要

目的:与痣相比,黑色素瘤中IL2诱导的T细胞激酶(ITK)启动子CpG位点低甲基化。然而,ITK在黑色素瘤中的表达尚未确定,需要进一步阐明。

实验设计:用一种ITK特异性单克隆抗体探测来自去鉴定、福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤块或细胞株阵列的切片,并通过IHC观察ITK。黑色素瘤细胞系的ITK蛋白水平不同,代表性细胞系用四种不同的慢病毒构建体转导,每种慢病毒构建体都含有一种旨在降低ITK mRNA水平的shRNA。还测定了选择性ITK抑制剂BI 10N对细胞株和小鼠模型的影响。

结果:ITK蛋白表达随着痣向转移性黑色素瘤进展而增加。在黑色素瘤细胞系中,ITK的基因或药物抑制降低了增殖和迁移,并增加了G0-G1期细胞的百分比。用BI 10N治疗患有黑色素瘤的小鼠,可降低表达ITK的异种移植物的生长或建立本地(Tyr-Cre/Pten(null)/Braf(V600E))黑色素瘤。

结论:我们得出结论,ITK以前被认为是一种免疫细胞特异性蛋白,在黑色素瘤中异常表达,并促进肿瘤的发展和进展。我们发现ITK在大多数转移性黑色素瘤中异常表达,这表明ITK抑制剂可能对黑色素瘤治疗有效。小分子ITK抑制剂在Tyr-Cre/Pten(null)/Braf(V600E)小鼠黑色素瘤模型中的疗效支持这种可能性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

潜在利益冲突的披露.作者没有利益冲突需要披露。

数字

图1
图1
黑素细胞组织中ITK的表达。(A) 正常皮肤(A)、良性痣(b)、原发性黑色素瘤(c)和转移性黑色素癌(d)的代表性组织切片用H&E(顶行)染色,或用ITK-Cy5(红色)和S100-Alexa 555(绿色)一级和二级抗体探测,并用DAPI(蓝色)复染。橙色表示ITK与黑素细胞谱系标记S100共存。黑素细胞组织染色的临床和组织学特征及其ITK水平见补充表S1。染色方案见补充表S2。(B) Box-and-Whisker图(中值为25-75第个痣(n=30)、原发性黑色素瘤(n=20)和转移性黑色素肿瘤(n=70)S100+细胞中ITK表达的百分位数和异常值。在转移性黑色素瘤中,91%(64/70)的ITK表达高于痣中ITK表达的范围。
图2
图2
ITK在黑色素瘤细胞系中的表达以及ITK缺失对其增殖和运动的影响。(A) Western blot分析从五个黑色素瘤细胞株获得的全细胞蛋白裂解物中的总ITK。蛋白质条带的信号强度归一化为GAPDH。还显示了补充表S3中的单元阵列IF值,以进行比较。(B) 对从VMM 39黑色素瘤细胞获得的蛋白裂解物中的总ITK进行Western blot分析,这些细胞是用靶向ITK mRNA(ITK 4、5、6和7)的shRNA序列和打乱(SCR)shRNA转导的。图中所示含ITK条带的积分值与GAPDH值进行标准化,以产生图中所显示的比率。(C)五种shRNAs对PMWK、VMM 39和RPMI 8322黑色素瘤细胞增殖率的影响。星号表示与SCR shRNA相比其增殖显著降低的黑色素瘤细胞系(P<0.05,Bonferroni校正;补充表S4A)。(D) 用各种shRNAs转导的PMWK、VMM 39和RPMI 8322细胞的单细胞运动分析。星号表示与SCR shRNA相比运动性发生显著变化(P<0.05,Bonferroni校正;补充表S4B)。
图3
图3
BI 10N对ITK磷酸化及黑色素瘤细胞增殖和运动的影响。(A) RPMI 8322细胞全细胞裂解物的Western blot分析。在分析之前,用指示浓度的BI 10N处理细胞3天。在分析之前,用磷酸酶处理未接受BI 10N的细胞提取物。在使用总ITK抗体进行Western blot分析之前,通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解产物中的蛋白质。百分比表示较小频带的面积占整个信号的百分比。(B) 增加BI 10N浓度对PMWK、VMM 39和RPMI 8322黑色素瘤细胞增殖率的影响。星号表示与未经处理的细胞相比,增殖显著降低(P<0.05,Bonferroni校正;补充表S4C)。(C) 增加BI 10N浓度对试验前24小时处理的PMWK、VMM 39和RPMI 8322黑色素瘤细胞运动的影响。星号表示与未经处理的黑色素瘤细胞相比,经BI 10N处理的细胞运动能力显著降低(P<0.05,Bonferroni校正;补充表S4D)。
图4
图4
BI 10N对肿瘤生长的影响体内(A)BI 10N(15mpk)对人类黑色素瘤异种移植生长的影响(平均值和标准平均值误差)。星号表明,与未经治疗的小鼠相比,BI 10N治疗显著抑制肿瘤生长(P<0.05,Bonferroni校正)。AZD6244(37 mpk)是一种抗黑色素瘤的活性剂,用于比较。样本大小在括号中表示。(B) 在CRE-ERT2 B-RafL/+PtenL/L基因工程小鼠模型(GEMM)中诱导的未经治疗的黑色素瘤组织的代表性切片。左侧面板用H&E染色,中间面板用生物素连接二级抗体染色,而右侧面板用抗总ITK抗体(红色)和生物素连接的二级抗体进行染色,然后用苏木精进行复染。下面的面板是每个图像的放大区域。(C) BI 10N对PTEN/BRAF GEMM中肿瘤生长的影响(平均值和标准误差)。星号表明,与未经治疗的小鼠相比,经BI 10N治疗的小鼠具有显著的肿瘤生长抑制作用(P<0.05,Bonferonni校正)。还显示了AZD6244和PLX4032对肿瘤生长的影响。C中显示的PLX4032的活性是GEMM模型的典型特征。样本大小在括号中表示。(D) 口服15毫克/公斤BI 10N的荷黑色素瘤小鼠存活时间更长。根据管理小鼠使用的协议,当肿瘤达到特定大小时,必须将动物处死。在9只经BI 10N治疗的动物中,有7只因治疗结束时出现多发性肿块而被淘汰,而原发性肿瘤仍有反应或尚未达到最终负担。1只动物的初级反应完全,由于年龄和IACUC时间限制,在133天时被淘汰。1只动物被扑杀,原因是初级动物正在进行,没有次级肿块。

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