跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2015年10月；22(10):1714-26.
doi:10.1038/cdd.2015.26。 Epub 2015年5月1日。

DRAM-3调节自噬并促进缺乏葡萄糖的细胞存活

M rschtik女士 1, J O’Prey公司 1, L Y老挝 1, J S长 1, F博马汀 1, D斯特拉坎 1, M O’Prey先生 1, J斯科默 1, K M瑞恩 1
附属公司

DRAM-3调节自噬并促进缺乏葡萄糖的细胞存活

M rschtik女士等。 细胞死亡差异. 2015年10月.

勘误表in

摘要

大自噬是一种膜运输过程，将细胞质成分输送到溶酶体进行降解。这一过程是在基本条件下进行的，作为一种机制来转换受损或错误折叠的蛋白质和细胞器。因此，它在保持细胞完整性和生存能力方面发挥着重要作用。除了这一基本功能外，还可以调节大自噬以应对各种形式的细胞应激，并且可以调整大自噬的速率和负荷，以促进特定情况下的适当细胞反应。宏观自噬机制由一组进化上保守的自噬相关（ATG）蛋白和其他一些自噬调节器调节，这些自噬调控器要么具有组织限制性表达，要么在特定环境下运作。我们在这里报道了一种新的自噬调节器的特性，我们称之为DRAM-3，因为它与损伤调节自噬调制器（DRAM-1）具有显著的同源性。DRAM-3在广泛的正常组织和肿瘤细胞中表达，但与DRAM-1不同，DRAM-3不是由p53或DNA损伤剂诱导的。免疫荧光研究表明，DRAM-3定位于溶酶体/自溶体、内体和质膜，但不定位于内质网、吞噬细胞、自噬体或高尔基体，表明与DRAM-1定位和与大自噬相关的细胞器有显著重叠。在这方面，我们进一步证明DRAM-3的表达在基础条件下导致自噬体的积累并增强自噬通量。反过来，CRISPR/Cas9介导的DRAM-3的破坏会损害自噬流量，从而证实DRAM-3是宏观自噬的调节剂。由于大自噬在饥饿条件下具有细胞保护作用，我们还测试了DRAM-3是否可以促进营养缺乏时的存活。这表明DRAM-3可以抑制细胞死亡，并促进在缺乏葡萄糖的情况下生长的细胞的长期克隆存活。然而，有趣的是，这种作用是与宏观自噬无关的。总之，这些发现构成了DRAM-3作为宏观自噬和饥饿条件下细胞存活调节器的主要特征。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
DRAM-3在各种人体组织和癌细胞系中表达。(一)DRAM-3和DRAM-1的对齐。DRAM-3在氨基酸水平上与DRAM-1有30%的相同性和43%的相似性。(b条)DRAM-3的示意图。DRAM-3预计编码233-aa蛋白，具有六个假定的跨膜结构域和一个预测的N末端信号肽。(c（c）)DRAM-3 mRNA在不同组织中的表达不同。Origene TissueScan人类正常cDNA阵列的qRT-PCR产物，在2%琼脂糖凝胶上使用针对DRAM-3的Origene引物。(d日)定量qRT-PCR(c（c）). GAPDH被用作标准。(e（电子）)一组癌细胞系中DRAM-3 mRNA的表达。通过qRT-PCR获得的结果。所有数值均测量为三倍，并归一化为18S RNA。红线表示qRT-PCR的检测限。(（f）)一组癌细胞系中DRAM-1 mRNA的表达。通过qRT-PCR获得的结果。所有数值均为三倍，并归一化为18S RNA。所有数值均高于检测限
图2
图2
DRAM-3在选定癌细胞系中的表达调控。(一)添加和不添加强力霉素的Saos-2 tet-on p53细胞的Western blot。强力霉素以时间依赖的方式诱导p53。(b条)DRAM-3不是由p53诱导的。在Saos-2 tet-on p53细胞中，添加强力霉素后不会诱导DRAM-3 mRNA，而DRAM-1 mRNA上调。通过qRT-PCR获得的结果。所示数据来自三个独立的实验，并绘制为平均值；误差条为S.E.M(c（c）,d日)p53-null Saos-2细胞DRAM-3 mRNA水平对各种刺激的反应分析(c（c）)或p53野生型U2OS细胞(d日). 通过qRT-PCR获得的结果。显示的值是相对于控制的，控制被规范化为1。所示数据来自三个独立的实验，并绘制为平均值；误差条为S.E.M(e（电子）,（f）)p53-null Saos-2细胞DRAM-1 mRNA水平对各种刺激的反应分析(e（电子）)和p53野生型U2OS细胞(（f）). 通过qRT-PCR获得的结果。显示的值是相对于控制的，控制被规范化为1。所示数据来自三个独立的实验，并绘制为平均值；误差条为S.E.M(c（c）–（f）)不含10%透析FBS的葡萄糖培养基
图3
图3
DRAM-3适用于多种蜂窝隔间(一–d日). 外源DRAM-3部分位于自噬体标记LC3B附近(一)，早期内体标记EEA1(b条)，溶酶体标记LAMP2(c（c）)和肌动蛋白涂层凹坑(d日). 肌动蛋白染色使用磷灰石红进行α-Myc-Tag抗体。免疫荧光分析在Zeiss 710共聚焦显微镜上进行，×63物镜。(e（电子）)含有DRAM-3的小泡与活细胞中含有Rab5的小泡紧密结合。通过磷酸钙转染将GFP标记的DRAM-3和RFP标记的早期内体标记物Rab5共同转染到Saos-2细胞。在Andor旋转盘共焦系统上至少2天后进行肝细胞成像。(（f）)含有DRAM-3的小泡部分位于活细胞中含有Rab7的小泡附近。通过磷酸钙转染将GFP标记的DRAM-3和RFP标记的晚期内体标记物Rab7共同转染到Saos-2细胞。在Andor旋转盘共焦系统上至少2天后进行肝细胞成像。(克)外源性DRAM-3不与高尔基体标记GM130共定位。免疫荧光分析在Olympus FV1000共聚焦显微镜上进行，×60物镜。(小时)外源性DRAM-3与内质网标记Calnexin不共定位。免疫荧光分析在Olympus FV1000共聚焦显微镜上进行，共聚焦显微镜×60物镜
图4
图4
DRAM-3不影响凋亡细胞死亡或细胞生长过程。(一)DRAM-3过表达不会诱导细胞凋亡。用强力霉素处理Saos-2 Tet-On DRAM-3细胞48 h，并通过FACS分析Sub-G1含量（凋亡死亡的可靠测量）。所示数据来自三个独立的实验，并绘制为平均值。误差条代表S.E.M.进行统计分析t吨-测试。(b条)强力霉素处理Saos-2 Tet-On DRAM-3细胞后强烈诱导DRAM-3表达。用强力霉素诱导细胞24、48和72 h、 并进行western blot分析以确保DRAM-3的表达。多西环素诱导的结构与Myc-His标签融合α-使用Myc标签抗体检测外源蛋白。(c（c）)通过Saos-2 EcoR细胞的嗜生性病毒感染产生稳定过度表达DRAM-3-Myc-His的细胞。通过qRT-PCR三次测量DRAM-3过度表达的程度，并将DRAM-3测量值归一化为18S RNA。数据表示平均值。误差线为S.D(d日)Saos-2 pWZL DRAM-3细胞表达DRAM-3蛋白。通过western blot，使用α-Myc-tag抗体。(e（电子）)稳定过度表达DRAM-3的Saos-2细胞不会出现增殖缺陷。DRAM-3过表达细胞和对照细胞在指定的天数内计数三倍，并生成6天的生长曲线。(（f）)用表达DRAM-3的逆转录病毒构建物（pWZL）感染Saos-2细胞不会影响标准生长条件下的克隆形成存活。选择后1周，低密度接种Saos-2 pWZL和pWZL-DRAM-3细胞
图5
图5
DRAM-3过度表达影响自噬过程。(一)在稳定过度表达DRAM-3的细胞中，LC3B puncta水平增加。用对照或饥饿培养基（EBSS）处理Saos-2细胞2 h，免疫荧光检测。在Zeiss 710共聚焦显微镜上用LC3B特异性抗体在×63物镜下观察内源性自噬体。(b条)量化(一). 免疫荧光堆栈以最大强度叠加，并使用图像J测量LC3B点相对于细胞面积的面积。每种情况下12个细胞的量化。学生的t吨-测试作为统计分析进行，图中的条形图表示平均值；错误为S.D。纳秒P（P）>0.05; **P（P）<0.01. (c（c）)在正常生长条件下，DRAM-3过表达增加LC3-II水平。稳定过度表达DRAM-3的Saos-2细胞受到1或2 h EBSS饥饿或补充10%FBS和谷氨酰胺的DMEM。(d日)DRAM-3过表达增加自噬流量。对稳定过度表达DRAM-3的Saos-2细胞进行5 μM氯喹治疗（CQ）2 小时(e（电子）)DRAM-3过度表达加速了细胞有丝分裂。用12.5 μM CCCP在24小时内两次 h期，然后通过western印迹分析线粒体数量，使用α-COX IV抗体。(（f）)DRAM-3过表达调节不同细胞系中的自噬流量。对稳定过表达DRAM-3的MDA-MB-231细胞进行1或2次 h EBSS饥饿或补充10%FBS和谷氨酰胺的DMEM。(克)DRAM-3过表达增加了不同细胞系的自噬通量。对稳定过度表达DRAM-3的MDA-MB-231细胞进行5 μM氯喹治疗（CQ）2 小时
图6
图6
德拉姆-3破坏并不影响吞噬体、自噬体和溶酶体的数量或定位。(一)lentCRISPR破坏DRAM-3（DRAM-3）在Saos-2细胞中。对感染含有慢病毒对照（GFP）或DRAM-3靶向结构的Saos-2细胞的基因组DNA进行CRISPR诱导的DNA移码测序。(b条)lentCRISPR细胞有效地灭活外源性DRAM-3-GFP的表达。将含有靶向GFP或DRAM-3的lentCRISPR结构的Saos-2细胞转染10 μg DRAM-3-GFP质粒，转染2天后收集进行western blot分析。(c（c）)DRAM-3基因敲除细胞饥饿自噬反应分析。Saos-2 DRAM-3被破坏，对照细胞被EBSS饥饿1-2次 小时(d日)DRAM-3中断后，自噬通量降低。Saos-2 DRAM-3被破坏，对照细胞被+/-添加5 μM氯喹（一种自噬流量的抑制剂）。(e（电子）)与自噬相关的细胞结构（吞噬细胞、自噬小体和自溶小体/溶酶体）的外观在DRAM-3破坏时没有改变。Saos-2 DRAM-3被破坏，对照细胞生长在盖玻片上，并用LC3B和WIPI2或LAMP2抗体进行免疫荧光分析。成像在带有×63透镜的蔡司LSM710显微镜上进行
图7
图7
DRAM-3促进葡萄糖饥饿后的存活。(一)DRAM-3过度表达可提高葡萄糖饥饿后克隆形成存活率。将稳定过度表达DRAM-3或对照构建物（pWZL）的Saos-2细胞置于DMEM无葡萄糖培养基+2%透析FBS h将饥饿培养基与生长培养基交换，使细胞恢复2–3天，然后用Giemsa染色。(b条)量化(一). 三个实验量化了细胞所占面积的百分比。一对学生的t吨-测试作为统计分析进行，图中的条形代表平均值；错误是S.E.M**P（P）<0.01。(c（c）)DRAM-3过表达可防止葡萄糖饥饿后细胞死亡。将稳定过度表达DRAM-3或对照构建物（pWZL）的Saos-2细胞置于DMEM无葡萄糖培养基+2%透析FBS h收集细胞并与碘化丙啶（PI；5）孵育 μg/ml）30 min，然后分析FACS Calibur上的PI摄取。五次实验的结果以平均值显示，一式三份；误差条是S.E.M.使用学生的t吨-测试*P（P）<0.05 (d日)葡萄糖饥饿后的细胞死亡并不涉及Saos-2细胞中的DNA断裂。将稳定过度表达DRAM-3或对照构建物（pWZL）的Saos-2细胞置于DMEM无葡萄糖培养基+2%透析FBS h收集细胞，固定并进行细胞周期分析。G1亚组分表明DNA片段化，这是细胞凋亡的标志。三次实验的结果一式三份。(e（电子）)添加10%透析血清和丙酮酸钠不会影响DRAM-3对葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡的作用。将稳定过度表达DRAM-3或对照构建物（pWZL）的Saos-2细胞置于DMEM无葡萄糖培养基+10%透析FBS+0.11 g/l丙酮酸钠。48岁之后 h收集细胞，并与碘化丙锭（5 μg/ml）30 min，然后分析FACS Calibur上的PI摄取。三次实验的结果以平均值显示，一式三份；误差条是S.E.M.使用学生的t吨-测试**P（P）<0.01 (（f）)在葡萄糖饥饿培养基中加入氯喹可阻断自噬流量。在全DMEM或无葡萄糖培养基中添加10微摩尔氯喹，补充2%的透析FBS，以阻止自噬体的周转。24天后采集蛋白质样本 h并进行western印迹处理。(克)用氯喹阻断自噬并不能消除葡萄糖缺乏条件下DRAM-3过度表达的影响。24天后收集细胞进行PI排除FACS分析 h.显示的数据来自四个独立实验，以平均值表示；误差条是S.E.M.学生的t吨-进行统计学分析*P（P）<0.05;纳秒P（P）>0.05
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

  • DRAM-4和DRAM-5是营养缺乏条件下自噬和细胞存活的代偿调节器。
    Barthet VJA、Mrschtik M、Kania E、McEwan DG、Croft D、O’Prey J、Long JS、Ryan KM。 Barthet VJA等人。 FEBS J.2022年7月；289(13):3752-3769. doi:10.1111/febs.16365。Epub 2022年2月4日。 FEBS J.2022年。 PMID：35060334 免费PMC文章。
  • DRAM是p53诱导的自噬调节剂，对细胞凋亡至关重要。
    Crighton D、Wilkinson S、O’Prey J、Syed N、Smith P、Harrison PR、Gasco M、Garrone O、Crook T、Ryan KM。 Crighton D等人。 细胞。2006年7月14日；126(1):121-34. doi:10.1016/j.cell.2006.05.034。 细胞。2006 PMID：16839881
  • DRAM-1编码调节自噬的多种亚型。
    Mah LY、O’Prey J、Baudot AD、Hoekstra A、Ryan KM。 Mah LY等人。 自噬。2012年1月；8(1):18-28. doi:10.4161/auto.8.1.18077。Epub 2012年1月1日。 自噬。2012 PMID：22082963 免费PMC文章。
  • 哺乳动物自噬和质膜。
    Pavel M，Rubinsztein DC公司。 Pavel M等人。 FEBS J.2017年3月；284(5):672-679. doi:10.1111/febs.13931。Epub 2016年11月6日。 FEBS J.2017年。 PMID：27758042 审查。
  • 生命、死亡和埋葬：自噬的多方面影响。
    Galluzzi L、Morselli E、Vicencio JM、Kepp O、Joza N、Tajeddine N、Kroemer G。 Galluzzi L等人。 生物化学Soc Trans。2008年10月；36（第5部分）：786-90。doi:10.1042/BST0360786。 生物化学Soc Trans。2008 PMID：18793137 审查。
查看所有类似文章

引用人

  • ATR的抑制通过破坏细胞骨架网络和通过大胞饮作用内化整合素来对抗胶质母细胞瘤的侵袭。
    Derby SJ、Dutton L、Strathdee KE、Stevenson K、Koessinger A、Jackson M、Tian Y、Yu W、Mclay K、Miswetta J、Alsharif S、Clarke CJ、Gilmour L、Thomason P、McGee E、McGarrity-Cottrell CL、Vanderlinden A、Collis SJ、Rominyi O、Lemgruber L、Solecki G、Olson M、Winkler F、Carlin LM、Heiland DH、Inman GJ、Chalmers AJ、Norman JC、Carruthers R、Birch JL。 Derby SJ等人。 神经肿瘤学。2024年4月5日；26（4）：625-639。doi:10.1093/neuonc/noad210。 神经肿瘤学。2024 PMID：37936324 免费PMC文章。
  • DRAM1促进溶酶体传递海洋分枝杆菌巨噬细胞。
    Banducci-Karp A、Xie J、Engels SAG、Sarantaris C、van Hage P、Varela M、Meijer AH、van der Vaart M。 Banducci-Karp A等人。 细胞。2023年3月7日；12（6）：828。doi:10.3390/cells12060828。 细胞。2023 PMID：36980169 免费PMC文章。
  • 自噬的DRAMing。
    Leytens A，Dengjel J。 Leytens A等人。 FEBS J.2022年7月；289(13):3731-3734. doi:10.1111/febs.16394。Epub 2022年2月20日。 FEBS J.2022年。 PMID：35184369 免费PMC文章。
  • DRAM-4和DRAM-5是营养缺乏条件下自噬和细胞存活的代偿调节器。
    Barthet VJA、Mrschtik M、Kania E、McEwan DG、Croft D、O’Prey J、Long JS、Ryan KM。 Barthet VJA等人。 FEBS J.2022年7月；289(13):3752-3769. doi:10.1111/febs.16365。Epub 2022年2月4日。 FEBS J.2022年。 PMID：35060334 免费PMC文章。
  • p53诱导的自噬调节多药耐药癌细胞的化疗和放疗抵抗。
    马S、孔丹、傅X、刘L、刘Y、薛C、田Z、李L、刘X。 Ma S等人。 剂量反应。2021年10月8日；19(4):15593258211048046. doi:10.1177/15593258211048046。电子收款2021年10月-12月。 剂量反应。2021 PMID：34646092 免费PMC文章。
查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，Klionsky DJ。自噬通过细胞自我消化对抗疾病。自然。2008;451:1069–1075.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Axe EL、Walker SA、Manifava M、Chandra P、Roderick HL、Habermann等。富含3-磷酸磷脂酰肌醇并动态连接到内质网的膜室中的自噬体形成。细胞生物学杂志。2008;182:685–701.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Hailey DW、Rambold AS、Satpute-Krishnan P、Mitra K、Sougrat R、Kim PK等。线粒体为饥饿期间的自噬体生物生成提供膜。细胞。2010;141:656–667.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ravikumar B、Moreau K、Jahreiss L、Puri C、Rubinsztein DC。质膜有助于自噬体前结构的形成。自然细胞生物学。2010;12:747–757.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Tooze SA，Yoshimori T.自噬体膜的起源。自然细胞生物学。2010;12:831–835.-公共医学

出版物类型