Flap Endonuclease 1 Limits Telomere Fragility on the Leading Strand

doi:10.1074/jbc.M115.647388

.2015年6月12日；290(24):15133-45.

doi:10.1074/jbc。M115.647388。 Epub 2015年4月28日。

襟翼核酸内切酶1限制先导链上的端粒脆性

附属公司

¹来自密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院癌症环境研究所细胞生物学、生理学和集成通信系，邮编63110。
²来自细胞生物学和生理学系。
^三来自细胞生物学、生理学和医学系。
⁴来自密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院癌症环境研究所细胞生物学和生理学系以及整合通信系，63110 Medicine，sheila.stewart@wustl.edu。

PMID： 25922071
预防性维修识别码：项目经理4463456
内政部： 10.1074/jbc。M115.647388型

襟翼核酸内切酶1限制先导链上的端粒脆性

丹尼尔·特斯利等。生物化学杂志. 2015.

.2015年6月12日；290（24）：15133-45。

doi:10.1074/jbc。M115.647388。 Epub 2015年4月28日。

附属公司

¹来自密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院癌症环境研究所细胞生物学、生理学和集成通信系，邮编63110。
²来自细胞生物学和生理学系。
^三来自细胞生物学系、生理学系和医学系。
⁴来自密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院癌症环境研究所细胞生物学和生理学系以及整合通信系，63110 Medicine，sheila.stewart@wustl.edu。

PMID： 25922071
预防性维修识别码：项目经理4463456
内政部： 10.1074/jbc。M115.647388型

摘要

冗余复制和修复系统的存在确保了基因组的稳定性，这突出了忠实的DNA复制的重要性。这种复杂性在具有挑战性的DNA模板中最为明显，包括高度重复或转录的序列。在这里，我们证明了皮瓣核酸内切酶1（FEN1），一种典型的滞后链DNA复制蛋白，是端粒正常、完整的领先链复制所必需的。我们发现FEN1核酸酶活性的丧失，而非DNA修复活性的丧失导致了股特异性端粒的脆弱性。此外，我们发现FEN1耗竭诱导的端粒脆性通过RNA聚合酶II抑制而增加，并通过异位RNase H1表达而得到挽救。这些数据表明，FEN1通过处理复制体和RNA聚合酶之间发生的双向碰撞产生的RNA:DNA杂交/瓣中间产物，限制了领先的股特异性端粒脆性。我们的数据揭示了第一个导致染色体特异性端粒脆性的分子机制，以及FEN1在主要染色体DNA复制中的第一个已知作用。由于在人类癌症中已经发现了FEN1突变，我们的发现增加了未解决的RNA:DNA杂交结构导致与癌症相关的基因组不稳定的可能性。

关键词：DNA复制；FEN1；癌症；基因组不稳定性；端粒；转录。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**α-Amanitin治疗可消除半衰期短的mRNA表达，但不会改变稳态TERRA水平。** *A、，*表达对照发夹的细胞c-Myc和SIAH1 mRNA表达的qPCR分析(*shCtrl键*)或FEN1缺失细胞(*shFEN1型*)，用载体或α-阿马尼汀（α-阿曼). α-amanitin处理细胞的mRNA水平显示为相对于载体处理细胞的倍数变化。使用ΔΔ计算折叠变化*C类_t吨*方法；对两个生物复制品的折叠变化进行平均，得出图表。*误差线*表示平均值的标准误差。*B、，*northern斑点杂交检测TERRA。从表达对照发夹的细胞中分离出RNA(*shCtrl键*)或FEN1缺失细胞(*shFEN1型*)用载体或α-鹅膏素（α-阿曼). 将RNA的连续稀释液加载到膜上。用核糖核酸酶A处理以控制基因组DNA污染的样品也被装载(+*核糖核酸酶A*). 将端粒重复序列DNA探针杂交到膜上(*端粒探针*)检测TERRA；用5S rRNA DNA探针剥离膜并进行再验证(5秒)作为加载控件。用放射自显影术观察细胞膜。*C中，*α-amanitin处理细胞中TERRA的定量。北方的斑点B类用荧光成像仪成像，并使用斐济通过密度计进行分析；α-amanitin处理细胞中的TERRA水平显示为相对于载体处理细胞的倍数变化。对两个独立实验求平均值以生成图形；*误差线*表示平均值的标准误差。

**图2。**
**FEN1缺失和转录抑制导致复制应激、DNA损伤反应和端粒脆性。** *A、，*FEN1表达、Chk1磷酸化的Western分析(*第345页*)和H2AX磷酸化（γ*H2AX型*)在控制中(*shCtrl键*)或FEN1-已完成(*shFEN1型*)用载体或α-amanitin（α-阿曼). β-catenin显示为荷载控制。*B、，*每个细胞γH2AX焦点的定量。两个独立的生物复制组合在一起。这个箱第25至75个百分位，中位数用*水平线*；*络腮胡子*标记第5百分位和第95百分位，以及点表示5%至95%范围之外的值。第页使用双尾Mann-Whitney计算值U型测试（***，第页<0.001（相对于shCtrl）。*C中，*γH2AX抗体染色的典型免疫荧光图像(绿色)和DAPI(蓝色)来自表达对照发夹的BJ成纤维细胞(*shCtrl键*)或FEN1耗尽(*shFEN1型*). 细胞用载体或α-阿马尼汀（α-阿曼)如图所示。这个*比例尺*(白色)表示25μm。*D、，*端粒脆性比率的代表性量化。第页使用双尾Mann-Whitney计算值U型测试（**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001).误差线表示平均值的标准误差。*E中，*表达对照发夹的BJ成纤维细胞经FISH处理的代表性中期染色体(*shCtrl键*)或FEN1耗尽(*shFEN1型*). 细胞用载体或α-阿马尼汀（α-阿曼)如图所示。中心粒是*绿色，*端粒是*红色。箭头*在放大的图像中标记易碎的端粒。

**图3。**
**RNA：DNA杂交体负责FEN1缺失诱导的主要股特异性端粒脆性。** *A、，*表达对照发夹的RPE1细胞经CO-FISH处理的代表性中期染色体(*shCtrl键*)或FEN1耗尽(*shFEN1型*)，有或没有外源性表达的RNase H1(*广告-RH1*). 领先的绞合复制端粒是*绿色，*和滞后链复制端粒*红色箭头*在放大的图像中标记易碎的端粒。*B、，*股特异性端粒脆性比率的代表性量化，主要股特异性的端粒脆性显示为绿色和滞后的股特异性端粒脆性*红色.p*使用双尾Mann-Whitney计算值U型测试（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01).误差线表示平均值的标准误差。*C中，*对照组FEN1和RNase H1表达的western分析(*shCtrl键*)或FEN1-已完成(*shFEN1型*)具有或不具有异位表达的RNase H1（Ad-RH1）的细胞。显示了相同RNase H1印迹的两次暴露。α-管蛋白显示为一种负载控制。

**图4。**
**RNA：DNA杂交是α-amanitin诱导的端粒脆性的原因。** *A、，*用FISH处理含有或不含有外源表达RNase H1的RPE1细胞的代表性中期染色体(*广告-RH1*)并用溶媒或α-阿马尼汀（α-阿曼). 中心粒是绿色端粒是*红色箭头*在放大的图像中标记易碎的端粒。*B、，*端粒脆性比率的代表性量化。第页使用双尾Mann-Whitney计算值U型测试（***，第页< 0.001).误差线表示平均值的标准误差。*C中，*RNase H1在有或无外源性表达的细胞中表达的西方分析(*广告-RH1*)用溶媒或α-阿马尼汀（α-阿曼). 显示了相同RNase H1印迹的两次暴露。α-管蛋白显示为一种负载控制。

**图5。**
**FEN1瓣核酸内切酶活性需要限制主要的股特异性端粒脆性。** *A、，*示意图显示了本研究中使用的FEN1等位基因。所示功能包括PIP盒(*项目实施计划*)，核定位信号(*荷兰统计局*)，C端区域(C类)和点突变。每个等位基因的复制能力、修复能力和挽救端粒脆弱性的能力（本研究）显示给*正确的。B、，*表达对照发夹的BJL成纤维细胞经CO-FISH处理的代表性中期染色体(*shCtrl键*)或FEN1耗尽(*shFEN1型*). 领先的绞合复制端粒是*绿色，*和滞后的绞合复制端粒红色FEN1等位基因在指示的地方外显表达。箭头在放大的图像中标记易碎的端粒。*C中，*表达对照发夹的BJ成纤维细胞经CO-FISH处理的代表性中期染色体(*shCtrl键*)或FEN1耗尽(*shFEN1型*). 领先的绞合复制端粒是*绿色，*和滞后的绞合复制端粒红色FEN1等位基因在指示的地方异位表达。箭头在放大的图像中标记易碎的端粒。*D、，*染色体特异性端粒易碎性的量化，主要特异性端粒易碎性显示在绿色和滞后的股特异性端粒脆性红色分析了两个独立的生物复制品，将每个突变组的shCtrl设置为1进行标准化，并进行组合。第页使用双尾Mann-Whitney计算值U型测试（***，第页<0.001（相对于shCtrl）。*误差线*表示平均值的标准误差。

**图6。**
**同向复制子RNAP碰撞后FEN1作用的模型。** *A、，*RNAP从富含C的主要链转录TERRA。复制体接近转录复合体，发生双向碰撞。Pol II与新生的TERRA分离。*B、，*复制体移动到TERRA的3′端，留下5′RNA瓣和RNA:DNA杂交。*C中，*复制体利用初生TERRA的3′端作为引物恢复主链的复制。*D、，*FEN1裂解碰撞留下的5′RNA瓣。*E中，*FEN1的分裂留下了一个缺口和一段可以修复的RNA：DNA杂交。*F、，*在缺乏FEN1、RNA:DNA杂交/瓣结构的情况下，积累并导致端粒脆弱。

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