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.2015年5月；21(5):483-91.
doi:10.1038/nm.3849。 Epub 2015年4月20日。

视网膜新生血管需要通过Robo1和Robo2的Slit2信号

尼古拉·拉玛 1, 亚历山大·杜布拉克 2, 托马斯·马西维特 三, Róisín-Ana níChárthaigh女士 1, 盖尔语基因 2, 布鲁内拉·克里斯托法罗 三, 劳伦斯·皮博因·弗拉格纳 三, 勒马 4, 安妮·艾希曼 5, 阿兰·切多托 1
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视网膜新生血管需要通过Robo1和Robo2的Slit2信号

尼古拉·拉玛等。 自然·医学. 2015年5月.

摘要

眼部新生血管疾病是致盲的主要原因。血管内皮生长因子（VEGF）阻断可提高视力，但并不是所有人对抗VEGF治疗都有反应，因此有必要采取其他措施来防止新生血管形成。狭缝家族蛋白（Slits）是Roundabout（Robo）受体的配体，可排斥神经系统中发育中的轴突。Robo1在眼部新生血管疾病中的表达发生改变，以前的体外研究报告了狭缝的促血管生成和抗血管生成作用。然而，支持缝隙在眼部新生血管形成中作用的遗传证据尚缺乏。在这里，我们生成了缺乏各种Slit和Robo蛋白的条件敲除小鼠，并发现Slit2通过Robo1和Robo2在小鼠出生后视网膜和眼部新生血管疾病模型中有效且选择性地促进血管生成。从机械上讲，Slit2通过Robo1和Robo2促进内皮细胞迁移。这些受体是Slit2和VEGF诱导的Rac1激活和跛足形成所必需的。因此，Slit2阻断剂可能用于治疗抑制眼部新生血管疾病患者的血管生成。

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数字

图1
图1
Slit2促进视网膜血管生成。(一)现场杂交狭缝1P7视网膜切片（最左侧和最右侧面板）或平板视网膜（中间面板）上的mRNA。血管用IB4染色（绿色）。洋红假彩色是就地信号。箭头表示水平单元格(n个=3视网膜）。(b条)现场杂交狭缝2P7视网膜切片（最左侧和最右侧面板）或平板视网膜（中间面板）上的mRNA。血管用IB4染色（绿色）(n个=2视网膜）。(c（c）)视网膜切片狭缝2+/−抗GFP染色的P10小鼠(n个=2视网膜）。(d日)Slit2-AP和VEGF-AP与野生型小鼠平装P5视网膜的结合。这些数据代表了每种情况下的9个视网膜。v、 静脉；a、 动脉。(e（电子）)现场杂交(狭缝2第8外显子特异性探针）狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−(n个=6）和CAG：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−(n个=11）只小鼠。对于狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−和CAG：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−小鼠在P0时给予三苯氧胺。(（f）)在P0注射三苯氧胺的小鼠的P7视网膜提取物中Slit2表达的蛋白质印迹定量（每个泳道一个视网膜）(n个= 3狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−视网膜；n个=11复合年增长率：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−视网膜*P（P）=0.02，Mann–Whitney试验）。(g、 小时)P7视网膜的平面安装狭缝-被IB4染色的敲除小鼠和对照鼠。支点密度(n个=24、13、32、11、15和19视网膜狭缝2液氧/液氧,狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−，CAG值：狭缝2液氧/液氧，复合年增长率：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−,狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−和狭缝2ΔEC狭缝1−/−小鼠）和血管覆盖率(n个=15、15、16、11、11和13视网膜狭缝2液氧/液氧,狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−，复合年增长率：狭缝2液氧/液氧，复合年增长率：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−,狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−和狭缝2ΔEC狭缝1−/−小鼠）。中最右侧的面板克显示用抗钙素（绿色）和抗钙结合蛋白（CaBP）（品红色）染色的切片(n个= 2狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−视网膜；n个=3复合年增长率：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−视网膜）。所有结果均以平均值±标准误差表示（另见补充表1）*P（P）<0.05时***P（P）<0.001，学生t吨-测试。标尺，50μm in一–c（c）,e（电子）和最右边的图像克; 150微米英寸d日; 中最左侧和中间图像中的500μm克以及所有面板小时.INL，内核层；IPL，内丛状层；ONL，外核层；RGCL，视网膜神经节细胞层。
图2
图2
视网膜血管生成异常机器人1-和机器人2-击倒老鼠。(一,b条)通过小鼠视网膜内皮细胞微阵列分析评估Robo表达(一)人内皮细胞mRNA的qPCR分析(b条（左）和相应人类内皮细胞的western blot(b条，右侧）。结果显示来自三个独立的实验。人脐静脉内皮细胞；人脐动脉内皮细胞；HDMEC，人真皮微血管内皮细胞。(c（c）–e（电子）)之后的机器人表达式机器人qPCR测定的HUVEC敲除(c；**P（P）< 0.01, ***P（P）与干扰siRNA控制（siCT）和western blot相比<0.001(d日)和小鼠肺内皮细胞（MLEC）机器人机器人-western blot测定的双基因敲除小鼠(e（电子）)（每组两个实验d日和e（电子）). siRobo，针对指定Robo蛋白的siRNA。(（f）)P5视网膜平板上Slit2-AP结合机器人-基因敲除小鼠(n个= 7,n个=2和n个=11视网膜机器人1−/−机器人2液氧/液氧,机器人4−/−和机器人1−/−机器人2ΔEC小鼠）。v、 静脉；a、 动脉。(克)P7的视网膜平装机器人1-和机器人2-IB4染色的敲除小鼠和对照小鼠。最右边的面板显示了被抗钙素（绿色）和抗CaBP（洋红；n个= 3机器人1−/−机器人2液氧/液氧视网膜；n个= 6机器人1−/−机器人2ΔEC视网膜）。(h、 我)分支点密度的量化（n）=10、23、21和21视网膜机器人2液氧/液氧,机器人1−/−机器人2液氧/液氧,机器人2ΔEC和机器人1−/−机器人2ΔEC分别是小鼠(小时);n个=12、8、8和6个视网膜机器人1+/−机器人2液氧/液氧机器人4+/−,机器人1−/−机器人2液氧/液氧机器人4−/−,机器人1−/−机器人2ΔEC机器人4+/+和机器人1−/−机器人2ΔEC机器人4−/−分别是小鼠(我)). (j个)来自P7的代表性扁平视网膜C类A类G公司:机器人2液氧/液氧机器人1−/−小鼠IB4染色。量化支点密度和血管覆盖率(n个= 6机器人2液氧/液氧机器人1−/−视网膜；n个=20个CAG：机器人2液氧/液氧机器人1−/−视网膜）。所有结果均以平均值±标准误差表示***P（P）<0.001，学生t吨-测试(小时)或Mann-Whitney试验(i、 j个). NS，不显著。用于比较的控件为机器人2液氧/液氧(小时)和机器人1+/−机器人2液氧/液氧机器人4+/−(我). 标尺，200μm in（f）中最左侧和中间图像中为500μm克和中j个中最右边的图像中为50μm克.
图3
图3
Slit2通过Robo1和Robo2促进新生血管生成。(一)来自指定菌株的扁平P7视网膜血管前部的内皮细胞增殖。红色，Erg-1/2/3；绿色，EdU；蓝色，IB4。增殖内皮细胞的百分比被量化(n个=13、16、9和21视网膜狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−，复合年增长率：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−,机器人1−/−机器人2液氧/液氧和机器人1−/−机器人2ΔEC小鼠）。(b、 c（c）)Dll4和Vegfr2染色的P7视网膜(n个=9、2、4和6视网膜狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−，复合年增长率：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−,机器人1−/−机器人2液氧/液氧和机器人1−/−机器人2ΔEC小鼠，分别在b条;n个=3、13、5和12视网膜狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−，复合年增长率：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−,机器人1−/−机器人2液氧/液氧和机器人1−/−机器人2ΔEC小鼠，分别在c（c）; 另见补充表1）。WT，野生型。(d日)的表达式素食主义者2(Kdr公司),编号1和素食主义者通过qPCR在分离自机器人1−/−机器人2Δ秒小鼠（上面板）和HUVEC中的siROBO1公司和siROBO2公司与加扰siRNA对照（siCT，下面板）相比。(e（电子）)使用Slit2或VEGF-A处理20小时的HUVEC（与PBS对照（CT）相比，上面板）和应用干扰对照siRNA或敲除ROBO1公司和ROBO2公司（下面板，与PBS控制相比）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (（f）)NOTCH信号分子在HUVEC中的表达ROBO1公司和ROBO2公司或第个，共个槽口1通过qPCR（上面板）和sDLL4刺激后（下面板）确定。(克)三维纤维蛋白凝胶中的HUVEC发芽（左）和量化（右）。细胞用siRNA处理，然后用重组蛋白处理96小时*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）与PBS治疗的对照组相比<0.001。(小时)HUVEC划痕迁移试验（左）和定量（右）。用siRNAs处理细胞，然后用重组蛋白处理16小时。虚线标记伤口迁移边缘***P（P）与PBS治疗的对照组相比<0.001。所有结果均以平均值±s.e.m.表示，由学生的t吨-测试(一)或双向方差分析和Tukey多重比较检验(n个=3个独立实验d日–小时). NS，不显著。标尺，50μm in一–c（c），180μm英寸克和小时.
图4
图4
ROBO1和ROBO2调节Slit2和VEGF-A诱导的RAC1激活。(一)伤后16小时，刮伤创面边缘（所有图像的左侧）HUVEC的Phalloidin（红色）和DAPI（蓝色）染色。如图所示，用siRNAs和重组蛋白处理细胞。靶向siRNAs处理的细胞ROBO1公司和ROBO2公司对Slit2和VEGF没有反应而形成跛足，但对bFGF有反应而形成。比例尺，45μm。(b、 c（c）)Slit2和VEGF在带有对照siRNA和siRNA靶向的HUVEC中诱导的RAC1-GTP负载ROBO1公司和ROBO2公司（刺激5分钟）(b条). 对三个独立实验的结果进行了量化(c（c）). *P（P）与PBS治疗对照组相比，<0.05。(d、 e（电子）)低剂量Slit2和VEGF治疗对RAC1-GTP负荷的影响（5分钟刺激）(d日). 对三个实验的结果进行了量化(e（电子）). *P（P）与PBS治疗对照组相比，<0.05。(f、 克)Slit2处理对siRNA控制的HUVEC和细胞中PAK2和AKT磷酸化的影响ROBO1公司和ROBO2公司(（f）). 对三个独立实验的结果进行了量化(克). *P（P）< 0.05, **P（P）与PBS治疗的对照组相比，<0.01。(h、 我)VEGF-A对控制siRNA和siRNA靶向HUVEC ERK和AKT磷酸化的影响ROBO1公司和ROBO2公司(小时). 对三个独立实验进行了p-AKT与总AKT的定量比较以及p-ERK与总ERK的定量比较(我). 所有值均为平均值±标准误差。P（P）使用Student的t吨-测试。
图5
图5
靶向Slit2–Robo信号阻断OIR中的血管生成。(a、 c、e、g)来自狭缝-淘汰赛(a、 c（c）)和机器人-淘汰赛(e（电子）)OIR后的小鼠。视网膜克来自注射了编码GFP的腺病毒（adCTL）或编码ROBO1-Fc的腺病毒的小鼠。A类新生血管萌芽和血管簇的高分辨率图像如所示c（c）; 图像显示中箭头（上部面板）和箭头（下部面板）指示的区域一. (b条)无血管面积的量化狭缝-基因敲除小鼠(n个=10、22、12和23视网膜狭缝2液氧/液氧,狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−，复合年增长率：狭缝2液氧/液氧和CAG：狭缝2液氧/液氧狭缝1−/−小鼠）。(d日)静脉新生血管的定量。(（f）)无血管面积的量化机器人-基因敲除小鼠(n个＝31，机器人2液氧/液氧机器人1−/−视网膜；n个=22，复合年增长率：机器人2液氧/液氧机器人1−/−视网膜）。(小时)注射编码GFP的腺病毒小鼠无血管区的定量(n个=10个视网膜）或编码ROBO1-Fc的腺病毒(n个=8视网膜）。所有结果均以平均值±s.e.m表示***P（P）<0.001，学生t吨-测试。NS，不显著。标尺，500μm1英寸一,e（电子）和克; 100μm英寸c（c）.
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