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.2015年4月20日;10(4):e0124562。
doi:10.1371/journal.pone.0124562。 2015年电子收集。

小鼠和人ES细胞培养条件下获得的两种猪iPSCs的多能性和代谢特征

附属公司

小鼠和人ES细胞培养条件下获得的两种猪iPSCs的多能性和代谢特征

张伟(音译)等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

家猪是干细胞研究和临床医学的优秀动物模型。目前还没有合适的培养条件来产生真正的猪胚胎干细胞(pESCs)和高质量的猪诱导多能干细胞(piPSCs)。在这项研究中,我们发现培养条件会影响piPSC的多能性和代谢特征。使用定义的人类胚胎干细胞(hESC)和小鼠ESC(mESC)培养条件,我们生成了两种类型的piPSCs,其中一种在形态上类似于hESCs(此处称为hpiPSCs),另一种类似于mESCs(这里称为mpiPCSs)。转录组分析和信号通路抑制结果表明,mpiPSC共享更多的mESC信号通路,如BMP通路和JAK/STAT通路,而hpiPSCs共享更多的hESC信号途径,如FGF通路。重要的是,mpiPSC比hpiPSC更有效地进行胚胎嵌合体掺入。此外,mpiPCS还显示了原始ESC的线粒体特征和脂滴积聚。这些证据可能有助于理解piPSCs中的基因调控网络和代谢,并促进真正的pESCs在转化医学中的衍生。

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竞争利益:提交人声明,不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。两类piPSC的特征。
(A) mpiPCS的菌落呈圆形和三维(底部)。hpiPSCs的菌落大而平坦(顶部)。标尺=500μm。hpiPSC和mpiPCS均为碱性磷酸酶(AP)阳性。标尺=200μm。(B) hpiPSC和mpiPCS中Oct4、Sox2、SSEA-1和SSEA-4的免疫细胞化学染色。标尺=200μm。(C) 表面标记物Tra-1-81和Tra-1-60在hpiPSC中呈阳性,但在mpiPCS中未检测到。标尺=200μm。(D) H3K27me3免疫染色后hpiPSC和mpiPCS的X染色体激活状态。在hpiPSC中观察到组蛋白H3K27 me3斑点的阳性信号,但在mpiPCS中未观察到。标尺=200μm。白色箭头表示单元格中的H3K27me3阳性点。(E) 免疫细胞化学分析两种类型piPSCs的EBs中的3种生殖层细胞,标记物包括βⅢ-管蛋白(外胚层)、α-SMA(中胚层)和Sox17(内胚层)。比例尺=200μm。(F) piPSCs畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色。左:内皮血管(外胚层);中部:肌肉(中胚层);右:肠样上皮(内胚层)。比例尺=200μm。(G) piPSCs的核型分析。
图2
图2。piPSCs在孤雌胚胎中的注射及其发育体外.
(A) 将mpiPCS注射到猪PA胚胎中。PA囊胚中mpiPCS呈EGFP阳性(上图)。在PA胚泡中,hpiPSC呈CM-Dil(红色)阳性(底部)。比例尺=100μm。(B) 这两种类型的piPSCs在体外被掺入PA胚胎中。(a) :将mpiPSCs(EGFP)掺入ICM和滋养层(TE)的胚泡中(箭头所示)。(b) :hpiPSCs(红色)并入胚泡(箭头所示)。比例尺=50μm。(C) 两种类型的piPSC的囊胚率(囊胚数/注射胚胎总数)无差异。mpiPSC的合并胚胎率(合并胚胎数/注射胚胎总数)显著高于hpiPSC*第页<0.05,(平均值±标准偏差,n=3)。
图3
图3。hpiPSC和mpiPCS的基因表达谱。
(A) mpiPCS、hpiPSC和pEFs差异基因的热图。(B) 文氏图显示mpiPCS和hpiPSC的基因表达模式与pEF的差异更大。(C) 典型的多潜能基因,如10月4日,销售4,Tbx3型,Epcam公司CDH1型与pEFs相比,两种类型的piPSC均上调(折叠变化>2)。(D) piPSCs与pEFs的GO项分析(p值<0.01)。(E) piPSCs与pEFs差异基因的KEGG通路分析(p值<0.01)。(F) 的表达式级别加塔3加塔6在hpiPSC和mpiPCS中。加塔3加塔6hpiPSC含量低(对数2折叠变化值<-1)。的表达水平加塔3mpiPCS中的值较低(日志2折叠变化值<-1),但加塔6高于加塔3在mpiPCS中(日志2折叠变化值>1)。(G) 的相对表达水平纳克加塔6通过定量RT-PCR分析评估mpiPSCs和hpiPSCs。mRNA水平归一化为EF-1α。相对mRNA水平纳克在hpiPSC中,hpiPSC的表达高于mpiPCS。相对信使核糖核酸水平加塔6在hpiPSC中下调***第页<0.001(平均值±标准差,n=3)。
图4
图4。mpiPSC和hpiPSC依赖于不同的信号通路。
(A) 参与JAK/STAT信号通路的选定基因的热图。(B) mpiPCS、hpiPSC和pEF中参与FGF/BMP/TGF-beta信号通路的选定基因的热图。(C) AP染色检测BMP抑制剂组和对照组的mpiPCS和hpiPSCs。标尺=200μm。(D) JAK抑制剂组和对照组piPSC的AP染色。标尺=200μm。(E) FGFR抑制剂和对照组培养的piPSC的AP染色。标尺=200μm。
图5
图5。两种PIPSC的代谢特征。
(A) 参与新陈代谢的选定基因的热图。(B) 相对mRNA水平Cpt1b型在hpiPSC和mpiPCS中*第页< 0.05, **第页<0.01(平均值±SD,n=3)(C)hpiPSC和mpiPSC的电子显微镜图像。白色箭头表示线粒体,黑色星号表示脂滴。标尺=0.5μm。(D) piPSCs的Mitotracker染色。Mitotracker深红色(a和d),Hoechst(b和e),覆盖层(c和f)。标尺=100μm。(E) 线粒体膜强度率(荧光强度/细胞面积(μm2))piPSC的*第页<0.05(平均值±SD,n=3)(F)piPSCs尼罗河红染色。尼罗河红(a和d),通过“Harmony”软件检测到PIPSC菌落中的脂滴。用彩色圆圈(b和e)、尼罗河红和赫斯特覆盖物(c和f)标记脂滴。标尺=100μm。(G) 脂滴强度速率(荧光强度/细胞面积(μm2))piPSC的***第页<0.001(平均值±标准偏差,n=3)。
图6
图6。模型显示了两种类型的piPSC之间的差异。
来自mESC培养基(2i+LIF)和hESC培养液(含bFGF)的两类piPSC在基因表达模式和代谢特征上表现出不同的特点。

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引用人

工具书类

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出版物类型

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赠款和资金

本研究得到了国家基础研究计划(2011CBB010012011CBA01102)、北京市自然科学基金(6152004)、国家千人计划和大学新世纪优秀人才计划(NCET-11-0482)的资助农业生物技术基金国家重点实验室(2015SKLAB6-18)。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。