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.2015年6月1日；308（11）：G904-23。
doi:10.1152/ajpgi.00333.2014。

人食管肌成纤维细胞分泌促炎细胞因子对酸性和Toll样受体4配体的反应

马修·加格斯, 妞妞, 约翰·G·瓦隆, 贾娜·宾克利, 黛博拉·C·鲁宾, 安妮莎·沙克尔

人食管肌成纤维细胞分泌促炎细胞因子对酸性和Toll样受体4配体的反应

马修·加格斯等。 美国生理学杂志胃肠测试肝脏生理学. .

摘要

胃食管反流病（GERD）中食管损伤、修复和炎症的病理生理学是复杂的。虽然大多数研究都集中于上皮对GERD损伤的反应，但我们对基质反应感兴趣。我们假设GERD中的上皮下食管肌成纤维细胞分泌促炎细胞因子，以应对通过上皮屏障破坏或通过扩张的上皮细胞间隙遇到的有害因素。我们通过免疫形态学分析测定了上皮下GERD和正常食管基质中肌成纤维细胞[-平滑肌肌动蛋白（-SMA）+波形蛋白+CD31-]的百分比。我们用IL-6和p65进行-SMA联合免疫。我们建立并鉴定了-SMA+波形蛋白+CD31-CD45-人食管肌成纤维细胞（HuEso MFs）的原代培养物。我们通过pH4.5酸化介质和Toll-like receptor 4（TLR4）配体、LPS和高迁移率族蛋白1（HMGB1）治疗，建立GERD模型，并测定肌成纤维细胞因子分泌对GERD损伤的反应。我们证明，梭形细胞肌成纤维细胞位于正常食管复层鳞状上皮的基底膜附近。我们发现GERD患者上皮下肌成纤维细胞增多，促炎途径激活。正常食管基质细胞的原代培养保留了肌成纤维细胞的形态，并表达了酸受体瞬时受体电位通道香草醛亚家族1（TRPV1）和TLR4。用酸和TLR4激动剂LPS和HMGB1刺激的HuEso MFs通过TRPV1和NF-B激活增加IL-6和IL-8分泌。我们的研究揭示了人类上皮下基质细胞在GERD相关食管损伤发病机制中的作用。这项研究的发现可以扩展到炎症性食管粘膜疾病中上皮-基质相互作用的研究。

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数字

图1。
图1。
正常人食管间质的免疫染色。在正常食管的全厚切片上进行苏木精和伊红染色。基质检查(n个= 4;A类和B类)显示鳞状上皮基底膜附近有纺锤形细胞的异质群体（箭头所示）。血管用箭头描绘。放大倍数，400×。免疫染色显示α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA；n个= 2;C类和E类)在形成血管的内皮细胞（箭头）和鳞状上皮附近的纺锤形细胞中表达（箭头）。波形蛋白免疫染色(n个= 2;D类和F类)显示在一些基质细胞中表达，包括形成血管的内皮细胞（箭头）和鳞状上皮附近的纺锤形细胞（箭头；A类和B类, 200×;C类和D类, 400×). 中的黑盒子C类和D类描述中显示的区域E类和F类(630×).
图2。
图2。
正常人食管中α-SMA阳性、波形蛋白阳性细胞的表达。正常食管中α-SMA[四甲基罗丹明异硫氰酸盐（TRITC）；红色]和波形蛋白（FITC，绿色）免疫染色的典型共焦图像(n个=9）显示(A类和B类). α-SMA和波形蛋白在鳞状上皮附近的纺锤形细胞（sq.epi；实心箭头）和内皮细胞中表达，内皮细胞形成血管，血管散布于固有层，偶尔在鳞状细胞（白色箭头）中表达。表达波形蛋白的绿色成纤维细胞（绿色，虚线箭头）散布在固有层(A类和B类; 放大40倍）。C类：高倍镜（100×）下正常食管免疫染色的典型共焦图像显示，α-SMA和波形蛋白在鳞状上皮附近的梭形肌成纤维细胞中共存（黄色箭头）。4个面板显示该细胞中4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色），α-SMA（TRITC，红色），波形蛋白（FITC，绿色）和α-SMA-维生素A共表达。分散的仅表达波形蛋白的成纤维细胞（绿色虚线箭头）和内皮细胞（白色箭头）也可见。
图3。
图3。
α-SMA和波形蛋白在正常食管和胃食管反流病（GERD）食管中的表达。正常食管中α-SMA（TRITC，红色）和波形蛋白（FITC，绿色）的免疫染色(A类和B类)和GERD食管活检(C类和D类)用免疫荧光显微镜观察。在正常食管中(A类和B类)，形成血管的内皮细胞组织成圆形（白色箭头），共表达α-SMA和波形蛋白。还观察到分散的仅表达波形蛋白的成纤维细胞（绿色，虚线箭头）和单一的纺锤形α-SMA-和波形蛋白共表达细胞肌成纤维细胞（白色箭头）。GERD活检(C类和D类)显示基质细胞增多。显示了两个具有代表性的图像。C类：观察到血管（白色箭头）和α-SMA阳性、波形蛋白阳性、纺锤形细胞（白色实心箭头）。D类：表达波形蛋白的成纤维细胞（绿色虚线箭头）也增加。
图4。
图4。
正常和GERD食管中α-SMA阳性、CD31-阴性基质细胞的表达。对正常食管进行α-SMA（TRITC，红色）和CD31（FITC，绿色）免疫染色(A类和B类)和GERD食管(C类和D类)活检以区分肌成纤维细胞（α-SMA+CD31−）和内皮细胞（α-SMA+CD31+）。用免疫荧光显微镜观察图像。正常食管(A类和B类)在形成血管的内皮细胞（箭头）中很容易观察到α-SMA和CD31的共表达。偶尔也观察到α-SMA+CD31−肌成纤维细胞（箭头）。GERD活检(C类和D类)，α-SMA+CD31−肌成纤维细胞的观察频率更高（箭头所示）。显示了2例GERD活检的代表性图像；放大400倍油。E类：对SMA+CD31−细胞进行量化。GERD食管(n个=5）与正常食管相比，上皮下SMA+CD31−肌成纤维细胞的百分比增加（平均7.8%vs.平均2.3%，P（P）< 0.05).
图5。
图5。
GERD肌成纤维细胞炎症通路的激活。对正常人的石蜡包埋、福尔马林固定食管活检进行IL-6和α-SMA免疫染色(n个=5）和GERD(n个=5）食管活检。用免疫荧光显微镜观察载玻片(A类和B类). 正常食管(A类)显示纺锤形α-SMA+肌成纤维细胞（箭头）和内皮细胞形成血管（箭头）；仅在内皮细胞中观察到IL-6（FITC，绿色）共染。具有代表性的GERD活检(B类)显示了ECM中IL-6的表达（FITC，绿色）（绿色，实心箭头）。观察到纺锤形α-SMA+肌成纤维细胞和周围的IL-6（白色箭头）。血管再次显示内皮细胞中IL-6的表达（箭头）。放大倍率，40×。对正常食管和GERD食管进行p65和α-SMA免疫染色。用共焦显微镜观察载玻片(C–E类). 正常食管(C类)在内皮细胞（箭头）中观察到胞质和细胞核p65的表达。肌成纤维细胞（箭头所示）不表达细胞核p65。在一个有代表性的GERD活检中(D类)在肌成纤维细胞中观察到p65的核移位（白色箭头）。E类：中方框所划分区域的放大倍数D类如图所示。
图6。
图6。
人食管基质细胞的原代培养。在电镀后数小时内，观察到部分漂浮细胞悬浮，松散地粘附在板底(A类; 箭头；放大100倍）。在24–48小时内，混合细胞悬浮液变平并粘附在平板底部，随后出现纺锤形细胞的生长(B类). 低浓度培养人基质细胞的代表性图像(C类)和高(D类)汇流以100倍的放大倍数显示。
图7。
图7。
人食管基质细胞原代培养中肌成纤维细胞、上皮细胞和造血标记物的mRNA表达。从食管基质细胞原代培养物[肌成纤维细胞1、2和3（MF1、MF2和MF3）]、18Co结肠肌成纤维纤维细胞、Het-1A食管上皮细胞和商业购买的外周血单个核细胞（PBMC）中获取RNA。生成cDNA，并通过定量RT-PCR（qRT-PCR）评估α-SMA、波形蛋白、E-cadherin和CD45 mRNA的表达。食管基质细胞（MF1-3）和结肠肌成纤维细胞系18Co细胞中容易检测到α-SMA和波形蛋白的mRNA表达。这些肌成纤维细胞标记物的mRNA表达在原代培养中是可变的。食管基质细胞和18Co细胞中未检测到E-Cadherin和CD45 mRNA的表达。食管上皮细胞Het-1A和PBMC中分别检测到E-Cadherin和CD45 mRNA。结果显示，在3个正常人食管的原代培养物中进行的3个单独实验具有代表性。
图8。
图8。
原代培养的人食管基质细胞表达α-SMA和波形蛋白。食管基质细胞第5-15段，生长在室载玻片上，显示α-SMA的表达(A类和D类，红色罗丹明）和波形蛋白(B类和E类，绿色FITC）。原代培养物共存α-SMA和波形蛋白(C类和F类，黄色）。蓝色表示DAPI核染色。
图9。
图9。
人食管基质细胞原代培养的细胞表面标记物特征。A类：显示了原代培养细胞的前向散射区（FSC-A）和侧向散射区（SSC-A）。总共有89.2%的事件被选通。基质细胞标记物CD90存在于原代培养的大多数（97.7%）人食管基质细胞上(B类). 原代培养细胞中食管基质细胞缺乏造血CD45的表达(C类)，内皮细胞CD31(D类)和上皮CD324标记物(E类). 阳性对照包括商业购买的人类单核细胞（HemaCare）。使用同位素对照测定每个抗体的非特异性染色。
图10。
图10。
人食管肌成纤维细胞（HuEso MFs）分泌促炎细胞因子对非细胞毒性酸的反应(A类). 用pH 4.5酸化培养基处理15和30分钟后的3、6和24小时，对细胞条件培养基的乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性活性进行评估，并与自发（海绵）和最大（最大）LDH释放进行比较。细胞处理15分钟后，LDH活性与自发释放相似[光密度（OD）=0.07]，并且没有产生细胞毒性。细胞处理30分钟后，LDH活性在3和6小时时略有但显著增加，细胞毒性在24小时时增加3倍*P（P）与自发LDH释放相比，<0.05。B类：酸化培养基处理食管肌成纤维细胞15分钟后，在第3、6和24小时增加IL-6分泌*P（P）与未处理细胞的恢复时间相比，<0.01。C类：酸化培养基处理的食管肌成纤维细胞在6和24小时时增加了IL-8的分泌*P（P）与未处理细胞的恢复时间相比，<0.05。
图11。
图11。
HuEso MFs表达功能性瞬时受体电位通道香草醛亚家族1（TRPV1），和(A类)通过qRT-PCR测定Het-1A、HuEso MFs（MF1-3）和18Co中TRPV1 mRNA的表达。与Het-1A细胞中的表达相比，显示了折叠变化。数据表示3个独立实验的平均值±SE。B类：immmunoblot在HuEso MFs（MF1-3）的细胞裂解液中显示97-kDa带，与报告的TRPV1大小一致。在Het-1A细胞中观察到类似大小的条带。在18Co细胞中通过免疫印迹未检测到TRPV1的表达。β-肌动蛋白作为负载对照。C1–C3：对TRPV1进行免疫染色，并用共焦显微镜检查图像。DAPI+FITC绿色TRPV1图像(顶部)和FITC绿色(底部)如图所示。C1：先前在上皮Het-1A中报道的TRPV1表达在这些细胞的立方细胞质中。指挥与控制：在食管MFs中观察到TRPV1（FITC，绿色）的细胞质表达。C3类：与Het-1A和食管MF相比，18Co中TRPV1的表达较弱。在所有检查的细胞中都观察到斑点状核染色，被认为是伪影（放大400倍油）。D类：在进行初步研究以确定TRPV1拮抗剂AMG9810的无毒浓度后，HuEso MFs用1-10μM AMG9810。在1.0μM AMG9810下，观察到结构性和酸刺激的IL-6分泌增加。在2.5、5和7.5μM AMG9810下，IL-6的组成性分泌不受影响，酸刺激的IL-6分泌被逐步抑制。在7.5μM AMG9810时，酸刺激IL-6分泌受到最大抑制。当AMG9810剂量>7.5μM时，构成性和刺激性IL-6分泌受到抑制。在酸处理和非酸处理细胞中，在AMG9810存在的情况下测定IL-6分泌。∧P（P）每剂量AMG9810在酸性与非酸性处理中<0.001*P（P）与无酸、无Bay 11-7082对照组的IL-6分泌相比<0.001#P（P）与没有Bay 11-7082的酸处理电池相比，<0.001。结果代表3个正常人食管原代培养物中3个单独实验的平均值±SE。P（P）用方差分析确定数值，然后用Bonferroni的多重比较检验。
图12。
图12。
HuEso MFs表达Toll样受体4（TLR4）并分泌促炎细胞因子以响应TLR4配体。A类：通过qRT-PCR评估3种原代培养物中TLR2和TLR4 mRNA的表达。TLR4 mRNA的表达比TLR2更深刻。结果显示，在3个正常人食管的原代培养物中进行的3个单独实验具有代表性。B类：免疫印迹法检测TLR4蛋白（94kDa）在食管肌成纤维细胞MF1-3、结肠肌成纤维纤维细胞18Co、人宫颈癌细胞系HeLa和人结肠癌Caco2细胞中的表达，作为阳性对照。β-肌动蛋白作为负荷对照。C类：对食管肌成纤维细胞（MF1）、18Co（阳性对照）和Het-1A（阴性对照）进行TLR4免疫荧光染色。通过荧光显微镜获得的TLR4蛋白图像显示，TLR4在食管肌成纤维细胞中的表达（红色TLR4；蓝色DAPI；放大200倍），与在18Co中观察到的类似。D类：经LPS处理的HuEso MFs在第3、6和24小时增加IL-8分泌*P（P）<0.05 vs.未治疗。E类经TLR4配体LPS和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）处理的食管肌成纤维细胞在6小时后增加IL-6的分泌(*P（P）<0.005 vs.6 h对照）和24 h(#P（P）<0.005 vs.24 h对照）。所示结果代表了3个独立实验的平均值±SE，这些实验是用3个正常人食管的原代培养物进行的。
图13。
图13。
酸和LPS处理的食管肌成纤维细胞中NF-κB通路的激活。食管肌成纤维细胞的原代培养物在无血清肌成纤维细胞培养基中的室载玻片中生长，并在10分钟、30分钟、1小时和3小时固定。这些细胞用作对照(A类). 用pH 4.5酸化培养基处理食管肌成纤维细胞15分钟，然后在无血清肌成纤维组织培养基中恢复10分钟、30分钟、1小时和3小时，并固定(B类). LPS中培养的细胞固定在相似的时间点(C类). 用DAPI复染法对细胞进行p65免疫染色。在无血清肌成纤维细胞培养基中培养的未经处理的细胞始终显示细胞质p65表达(A类，绿色细胞质，蓝色DAPI染色细胞核）。用酸化介质处理的细胞(B类)细胞核内有绿色斑点，与10min开始的核移位一致（箭头），与未处理细胞相比，在30min和1h观察到p65的核染色更强烈（箭头）。在3小时时，用酸化培养基处理的食管肌成纤维细胞显示出主要的细胞质p65染色。放大倍数，400×。LPS处理的细胞(C类)显示绿色核斑点，细胞质染色最少，与近完全p65核易位一致，开始于30min，持续于3h。D类：从无血清肌成纤维细胞培养基（SF）中生长的原代培养物和经LPS处理的培养物中获取细胞裂解物，并在处理后的指定时间点（30分钟、1小时和3小时）获取。对从未经处理的细胞和经LPS处理的细胞中提取的蛋白进行NF-κBα抑制剂（IκB a）的免疫印迹。作为负荷控制，去除斑点并重新培养微管蛋白。在每个时间点，用LPS治疗后，IκBα的表达都会减少(顶部). 通过使用ImageJ软件将IκBα条带的密度测定标准化为微管蛋白负荷控制，实现IκA条带的相对定量。
图14。
图14。
HuEso MFs通过激活NF-κB通路分泌IL-6以响应酸和TLR4配体。A类：IL-6分泌是在酸处理细胞和非酸处理细胞中Bay 11-7082浓度增加的情况下测定的。Bay 11-70 82在5μM时导致IL-6分泌显著减少，但不影响组成性分泌。∧P（P）每剂量Bay 11-7082的酸处理与非酸处理<0.001*P（P）与无酸、无Bay 11-7082对照组的IL-6分泌相比<0.001#P（P）与没有Bay 11-7082的酸处理电池相比，<0.001。结果代表3个正常人食管原代培养物中3个单独实验的平均值±SE。P（P）用方差分析确定数值，然后用Bonferroni的多重比较检验。B类：HuEso MFs在3、6和24小时增加IL-6分泌，以应对LPS。基于初步研究，使用5μM Bay 11-7082测定NF-κB抑制对LPS刺激的IL-6分泌的影响，在24小时时，该分泌被5μM Bay 11-7082.抑制。Bay 11-7082处理在第3和6小时未进行评估。∧P（P）在每个时间点，LPS组<0.001，而非LPS组#P（P）不含Bay 11-7082的LPS处理细胞中IL-6分泌<0.01。结果代表3个正常人食管原代培养物中3个单独实验的平均值±SE。P（P）用配对的Student’st吨-测试。
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