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.2015年4月14日；8（372）:ra34。
doi:10.1126/scisignal.aaa5903。

mTORC1/4E-BP途径协调血红蛋白生成与L-亮氨酸可用性

钟学友 1, 丹尼尔·鲍尔 2, 阿里雷扎·加马里 2, 克里斯托弗·P·尼齐 3, Kathryn M甲板 3, 保罗·D·金斯利 4, 伊维特·叶恩 1, 尼古拉斯·C·休斯顿 1, 陈才勇 1, 伊曼·J·舒尔茨 1, 亚瑟·J·道尔顿 1, 约翰内斯·维蒂格 1, 詹姆斯·巴利斯 4, 斯图亚特·霍金 2, 哈维·F·洛迪什 5, 理查德·艾森斯坦 3, 阿兰·坎托 2, 巴里·H·帕 6
附属公司

mTORC1/4E-BP途径协调血红蛋白生成与L-亮氨酸可用性

钟学友等。 科学信号. .

摘要

在多细胞生物中，不同细胞类型获得不同氨基酸的机制以及细胞功能如何适应其可用性是生物学中的基本问题。我们发现，中性必需氨基酸（NEAA）摄取增加是红细胞生成的关键组成部分。随着红细胞成熟，氨基酸转运蛋白基因Lat3的表达增加，这增加了NEAA的输入。药物抑制或RNAi介导的LAT3敲除导致NEAA摄取不足，从而通过mTORC1（雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶点）/4E-BP（真核翻译起始因子4E-结合蛋白）途径，导致斑马鱼胚胎和小鼠红系细胞中血红蛋白生成的特异性降低。CRISPR介导的小鼠红系细胞中4E-BP家族成员的缺失使其对mTORC1和LAT3抑制产生耐药性，并恢复血红蛋白的产生。这些结果确定了LAT3在红细胞中的发育作用，并证明mTORC1作为一种稳态传感器，将转化水平的血红蛋白生成与NEAA（尤其是L-亮氨酸）的充分摄取结合起来。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。红细胞增多症包括NEAA摄取增加纬度3表达
（A）胎儿肝细胞从R1至R5期成熟时的RNAseq基因表达分析（登录号GSE32110），显示LAT3 mRNA与其他终末红细胞转录物的诱导。CD98是LAT1和LAT2所需的共转运体，在任何分化阶段均未检测到。（B和C） 纬度3通过放射性标记检测E14.5小鼠胚胎中的mRNA表达就地杂交（假彩色红）（B）和通过qRT-PCR（C）分化MEL细胞，显示纬度3红细胞生成组织和红细胞成熟过程中的mRNA。（D）用二甲基亚砜在不同时间诱导未分化和分化MEL细胞的裂解液用抗LAT3或抗GAPDH抗体进行免疫印迹。（E到I）对[3H] -在所指示的MEL细胞群（E）、分化（第3天）对照组或稳定组中监测4分钟以上的L-亮氨酸纬度3shRNA-表达MEL细胞（F至H），或用指示的非放射性氨基酸（I）处理的分化（第3天）MEL细胞。对于（I），*表示与MOCK治疗的显著差异。（J）稳定表达对照或纬度3-靶向shRNAs。将每个氨基酸的百分比归一化为相应的未分化样品*第页-值<0.05。平均值±SEM，n=（C）、（E）、（F）、（H）、（I）和（J）的3个独立实验。N=（B）的2个胚胎。N=（D）和（G）的2个独立实验。FL：胎肝；IB：免疫印迹；未区分：未区分；Diff：差异化；shRNA：短发夹RNA；BCH:2-氨基双环-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸。
图2
图2。NEAA不足降低红细胞血红蛋白化
（A和B） 现场使用特异性探针进行杂交纬度3a,纬度3b，或gata-1型在24 hpf野生型胚胎（A）或突变鱼类（B）上进行。ICM，红色箭头；体节在这个发育阶段位于ICM的背部，即黑色箭头。每个面板（A）的左下角提供了后部ICM的放大视图。比例尺代表0.2μm。（C至F）从对照或变形体72 hpf斑马鱼胚胎中分离总RNA，并进行定量PCR分析（C）。来自Tg的对照胚胎或变形胚胎(珠蛋白-LCR：eGFP）（D）或Tg(gata-1型：用流式细胞术分析eGFP（E）转基因株系。对照组或变形野生型（F）斑马鱼用o（o）-二茴香胺检测72hpf时的血红蛋白化。比例尺代表0.2μm。（G和H） o（o）-在用BCH或对照或稳定处理的MEL细胞上进行二胺西丁染色纬度3shRNA-表达MEL细胞。（I至J）从感染慢病毒的分化胎儿肝细胞中分离出总RNA，表达指示的shRNA，并进行定量PCR（I）。这些原代胎儿肝细胞用o（o）-二茴香胺（J）*第页-值<0.05。平均值±SEM，n=（C）、（D）、（E）、（G）、（H）、（I）和（J）的3个独立实验。（A）、（B）和（F）中的图像代表了2个独立实验，每个实验每个条件至少包含40个胚胎。shRNA：短发夹RNA；MO：吗啉；hpf：受精后小时数；BCH:2-氨基双环-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸。
图3
图3。在限制NEAA可用性的情况下，α/β-珠蛋白翻译优先降低
（A和B）未分化（第0天）和成熟（第3或4天）对照或纬度3对表达shRNA的MEL细胞进行裂解，并用所示抗体进行免疫印迹。（C）从未分化（第0天）和分化（第3天）对照或纬度3-小鼠shRNA表达细胞及半定量RT-PCR分析α-珠蛋白,β主球蛋白、和Hprt（小时）已执行。（D）控制或Lat3型表达shRNA的分化MEL细胞被代谢标记有或没有L-AHA。新生蛋白用链霉亲和素HRP显示，其他蛋白用免疫印迹法检测。（E和F）在分化对照或纬度3DMSO分化第3天时表达shRNA-的MEL细胞。代表性轮廓如（E）所示，其中向上箭头表示分数收集的开始。对三个独立实验的结果进行密度分析，并以总RNA（F）的百分比表示。图表显示平均值±SEM。（G）对用BCH处理的分化MEL细胞（第3天）进行非放射性代谢标记。用链霉亲和素HRP观察新生蛋白，并用抗α-珠蛋白抗体进行免疫印迹。n=（A）、（B）、（D）和（G）的2个独立实验，n=（C）的3个独立实验。IB：免疫印迹；shRNA：短发夹RNA；L-AHA：L-叠氮高丙氨酸；HRP：辣根过氧化物酶。
图4
图4。mTORC1在成熟的红细胞中感应到足够的NEAA摄取，尤其是L-亮氨酸
（A）从第0天开始，BCH处理的MEL细胞含有或不含有各种氨基酸酯o（o）-分化第4天，二茴香胺染色检测血红蛋白化。（B和C）用BCH和酯化氨基酸（B）的指定组合处理第3天分化的MEL细胞，对其进行非放射性代谢标记。通过三个独立实验的密度测定法对相对蛋白质丰度进行量化，并将其归一化为α-珠蛋白（C）的总量。（D）第3天区分控制或纬度3-用所指示的抗体对表达shRNA的细胞裂解物进行免疫印迹。（E）从对照或纬度3a-MO2注射斑马鱼胚胎用所示抗体进行免疫印迹。（F至I）用圆环蛋白1（F和G）或雷帕霉素（H和I）处理MEL细胞，并用o（o）-二茴香胺染色（F和H）或免疫印迹（G和I）。（J和K）斑马鱼胚胎用指定的化合物处理，并用o（o）-二茴香胺（J）或经western blotting（K）裂解分析。（J）中的比例尺代表0.2μm。（左）在第3天进行非放射性代谢标记，分化用鸟嘌呤1和酯化氨基酸的指定组合处理的MEL细胞*第页-值<0.05。平均值±SEM，n=（A）、（C）、（F）和（H）的3个独立实验。N=（D）、（E）、（G）、（I）、（K）和（L）中的2个独立实验。（J）中的图像是两个独立实验的代表，每个实验至少有40个胚胎。IB：免疫印迹；shRNA：短发夹RNA；L-AHA：L-叠氮高丙氨酸；HRP：辣根过氧化物酶。
图5
图5。α/β-珠蛋白转录本是直接的mTORC1翻译靶点
（A）小鼠和人类最常见的转录起始位点（TSS）α/β-珠蛋白利用RefSeq、ENSEMBL和UCSC数据库中的数据分析mRNA是否存在5′末端寡嘧啶域（TOP）样基序或富含嘧啶的翻译元件（PRTE）。（B）对经torin 1处理的分化MEL细胞（第3天）进行非放射性代谢标记。用链霉亲和素HRP观察新生蛋白，并用抗α-珠蛋白抗体进行免疫印迹。N=2个独立实验。（C和D）在DMSO分化的第3天，对分化对照细胞或经圆环蛋白1处理（2小时）的MEL细胞进行多糖体分析和半定量PCR。代表性轮廓如（C）所示，其中向上箭头表示分数收集的开始。对三个独立实验的结果进行密度分析，将结果归一化为总mRNA表达（D）。图表显示平均值±SEM。IB：免疫印迹；L-AHA：L-叠氮高丙氨酸；HRP：辣根过氧化物酶。
图6
图6。α/β-珠蛋白翻译受4E-BP蛋白调节
（A）4EGI-1或DG2处理后，在第4天用邻二茴香胺对分化的MEL细胞进行染色。（B）斑马鱼胚胎在72 hpf时用4E-BP模拟物4EGI-1处理，并用o（o）-二茴香胺。比例尺代表0.2μm。（C和D）野生型或DKO（两者均缺乏eif4ebp1和eif4ebp2)MEL细胞在有或没有BCH（C）或托林1（D）的情况下分化，并用o（o）-二茴香胺。（E到H）用L-AHA对野生型或DKO细胞进行非放射性代谢标记实验，短期BCH（E和F）或torin 1（G和H）处理。用所示抗体通过免疫印迹法检测蛋白质，而用链霉亲和素-HRP结合物（E和G）检测生物素化的新生蛋白质。在三个独立实验（F和H）上进行了密度分析。新生的α/β-珠蛋白合成被标准化为α-珠蛋白表达。（I和J）用BCH（I）或torin 1（J）和酯化氨基酸的指定组合处理第3天分化的DKO MEL细胞，对其进行非放射性代谢标记*第页-值<0.05。平均值±SEM，n=（A）、（C）、（D）、（F）和（H）的3个独立实验。（B）中的图像代表每次处理至少有40个胚胎的2个独立实验。N=（I）和（J）的2个独立实验。IB：免疫印迹；L-AHA：L-叠氮高丙氨酸；HRP：辣根过氧化物酶。
图7
图7。在红细胞生成过程中，mTORC1将血红蛋白转化与足够的NEAA摄取相协调，尤其是L-亮氨酸
描述我们的模型的示意图，其中成熟的红细胞依赖LAT3介导的NEAA摄取来维持体内平衡。在缺乏足够摄取的情况下，NEAA含量的降低，尤其是L-亮氨酸，触发了mTORC1/4E-BP信号的降低以及随后珠蛋白翻译的抑制。这种机制不同于先前确定的eIF2α依赖机制，该机制在严重氨基酸剥夺（GCN2）或血红素可用性（HRI）时被激活。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 红细胞生成中的氨基酸摄取。
    内森总经理。 内森总经理。 科学信号。2015年4月14日；8（372）：第9节。doi:10.1126/scisignal.aab1203。 科学信号。2015 PMID：25872868

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