Spy1 Protein Mediates Phosphorylation and Degradation of SCG10 Protein in Axonal Degeneration

doi:10.1074/jbc.M114.611574

.2015年5月29日；290(22):13888-94.

doi:10.1074/jbc。M114.611574。 Epub 2015年4月13日。

Spy1蛋白介导轴索变性中SCG10蛋白的磷酸化和降解

刘永华¹, 王友华¹, Ying Chen（陈莹）¹, 李晓红¹, 焦洋¹, 杨柳¹, 沈爱国²

附属公司

¹来自江苏省医学院炎症与分子药物靶标重点实验室。
²来自医学院、江苏省炎症与分子药物靶点重点实验室、江苏省神经再生重点实验室、南通大学神经再生协同创新中心，南通226001shen_aigo@yahoo.com。

PMID： 25869138
预防性维修识别码：项目经理447963
内政部： 10.1074/jbc。M114.611574号

Spy1蛋白介导轴索变性中SCG10蛋白的磷酸化和降解

刘永华等。生物化学杂志. 2015.

.2015年5月29日；290(22):13888-94.

doi:10.1074/jbc。M114.611574。 Epub 2015年4月13日。

作者

刘永华¹, 王友华¹, Ying Chen（陈莹）¹, 李晓红¹, 焦洋¹, 杨柳¹, 沈爱国²

附属公司

¹来自江苏省医学院炎症与分子药物靶标重点实验室。
²来自医学院、江苏省炎症与分子药物靶点重点实验室、江苏省神经再生重点实验室、南通大学神经再生协同创新中心，南通226001shen_aigo@yahoo.com。

PMID： 25869138
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Spy1蛋白在轴突变性中介导SCG10蛋白的磷酸化和降解。
刘毅、王毅、陈毅、李旭、杨杰、刘毅和沈A。刘毅等。生物化学杂志。2016年10月28日；291(44):23365. doi:10.1074/jbc。A114.611574。生物化学杂志。2016 PMID：27794104 免费PMC文章。没有可用的摘要。

摘要

轴突丢失是一种广泛的神经疾病的破坏性后果，没有明确的机制。最近的数据表明SCG10是一种新的轴突维持因子，损伤后SCG10的快速丢失需要JNK活性；JNK如何诱导SCG10降解尚不清楚。在这里，我们表明SCG10是Spy1（Spedy/RINGO家族蛋白）的结合伙伴，Spy1参与坐骨神经损伤的细胞反应。在轴突损伤的早期阶段，Spy1的表达与SCG10呈负相关。Spy1以JNK依赖的方式部分介导SCG10磷酸化和降解。抑制Spy1可减弱SCG10磷酸化并延迟损伤诱导的轴突变性。综上所述，这些数据表明Spy1是SCG10的一个重要调节因子，可以作为未来轴保护治疗的靶点。

关键词：JNK；SCG10；间谍1；轴突；轴突丢失；分子细胞生物学；神经突起生长；神经退行性疾病；磷酸化；蛋白质磷酸化；蛋白质稳定性；蛋白质相互作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**SCG10是Spy1的绑定合作伙伴。** A类，间谍1与SCG10互动*在体外*GST下拉试验通过培养*在体外*-翻译His-tagged Spy1，纯化GST-SCG10固定在谷胱甘肽-Sepharose珠上。GST-SCG10（而非GST）被证明会拉低Spy1。箭头表示GST和GST-SCG10条带，考马斯蓝染色表示装载量。*工作分解结构*，Western blot。BHA-标记的Spy和Myc-标记的SCG10在HEK-293细胞中共同表达，它们可以相互作用。*IP（IP）*，免疫沉淀。C类DRG神经元内源性Spy1和SCG10之间的相互作用，使用SCG10特异性抗体进行免疫沉淀分析。在HEK-293细胞中共表达Myc-tagged SCG10突变体和HA-taged Spy突变体，用于免疫沉淀分析。D类和E类类stathmin域(*SLD公司*)绑定到Spy1需要SCG10的。F类和*G公司*，Speedy/RINGO域(*S/R（序列号）*)需要Spy1的才能绑定到SCG10。

**图2。**
**在轴突损伤早期，Spy1表达与SCG10呈负相关。** A类对培养的DRG轴突中内源性SCG10和Spy1进行免疫印迹分析。针对神经元特异性β3-微管蛋白的免疫印迹证实了可比较数量的蛋白质负载。B密度测定法测定未切割和切割轴突中Spy1或SCG10蛋白与β3-微管蛋白的比值。数据为平均值±S.E(n个= 3, *, #,第页<0.01，与未切割组有显著差异）。C类坐骨神经远端轴切断前后内源性SCG10和Spy1的免疫印迹分析。针对神经元特异性β3-微管蛋白的免疫印迹证实了可比较数量的蛋白质负载。D类密度测定法测定未切割和切割轴突中Spy1或SCG10蛋白与β3-微管蛋白的比值。数据为平均值±S.E(n个= 3, *, #,第页<0.01，与未切割组有显著差异）。

**图3。**
**Spy1以JNK依赖的方式部分介导SCG10磷酸化和降解。** A类，蛋白质印迹(*国际银行*)Spy1过度表达后HEK-293细胞中SCG10表达的分析。B用密度计测定HA或Myc蛋白与GAPDH的比值。数据为平均值±S.E(n个= 3, *, #,第页<0.01，与第一组有显著差异）。C类、Western blot分析过表达Spy1或20μ米MG132持续3小时。D类用密度计测定HA或Myc蛋白与GAPDH的比值。数据为平均值±S.E(n个= 3, *, #,第页<0.01，与第一组有显著差异）。E类SCG10磷酸化和特定磷酸化位点的Western blot分析(*p-SCG10型*)Spy1过度表达后在HEK-293细胞中表达。Myc标记的SCG10 WT、S50A、S62A、S73A和S97A在HEK-293细胞中共同表达，并被抗Myc抗体拉下，然后与抗磷酸丝氨酸抗体孵育。*IP（IP）*，免疫沉淀。F类Spy1、JNK激酶抑制剂SP600125或CDK2抑制剂过度表达后HEK-293细胞SCG10磷酸化的Western blot分析。*G公司*Spy1过度表达后HEK-293细胞JNK磷酸化的Western blot分析。*磷酸化c-jun氨基末端激酶*，磷酸化JNK；*t-JNK公司*，总计JNK。

**图4。**
**抑制Spy1可减弱SCG10磷酸化并延缓损伤诱导的轴突变性。** A类慢病毒shRNA下调DRG神经元中Spy1的表达。制备了Spy1和GAPDH负荷控制的裂解液，并通过Western blotting进行分析。B，对DRG培养物进行轴切（切割），并用对照慢病毒shRNA、Spy1 shRNA#3或15μ米SP600125持续3 h，通过将人Spy1 cDNA与大鼠特异性Spy1 shRNA#3共表达来恢复Spy1的表达。对远端轴突进行Western blot分析，以评估SCG10的凝胶流动性。Spy1-shRNA-处理的轴突优先保存低分子量SCG10，类似于JNK激酶抑制剂SP600125的作用。β3-管蛋白显示为负载控制。C类密度测定法测定SCG10蛋白与β3-微管蛋白的比值。数据为平均值±S.E(n个= 3, *, #,第页<0.01，与未切割组有显著差异）。D类轴切断后12小时，从感染指定治疗的DRG培养物中采集轴突的相控图像。E类，从中获得了退化指数B并在轴切开后绘制时间曲线。在轴切开术后0、9和12小时，n个= 12–15; 轴切开24小时后，n个= 6–8; *, #,第页< 0.05, ***, ###,第页< 0.001与通过方差分析控制慢病毒。*误差线*代表S.E。*不另说明。*，不显著。

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