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.2015年3月4日；17(1):31.
doi:10.1186/s13058-015-0539-6。

小鼠乳腺干细胞表达三阴性乳腺癌的预后标志物

凯利·索迪, 霍华德·肯德里克, 琼高, 安德鲁·塔特, 马克塔·兹韦利比尔, 莉莉亚娜·多尔多内斯, 杰玛奎斯特, 大卫·魏敏·谭, 克莱尔·M·伊萨克, 安妮塔·格里戈里亚迪斯, 马修·斯莫利

小鼠乳腺干细胞表达三阴性乳腺癌的预后标志物

凯利·索迪等。 乳腺癌研究. .

摘要

简介：三阴性乳腺癌（TNBC）是一组异质性肿瘤，化疗是目前系统治疗的主要手段，最初通常是有益的，但复发和转移的风险很高。目前没有办法预测哪些TNBC会复发。我们验证了以下假设：正常干细胞的生物学特性在肿瘤转移中被重新激活，因此，原发性TNBC中正常乳腺干细胞相关基因集的激活将对复发和转移具有较高的预后。

方法：通过流式细胞术分离乳腺基底干细胞和肌上皮细胞，并在低剂量移植试验中进行测试。基因表达微阵列用于建立干细胞和肌上皮细胞的表达谱；将它们相互比较，并与我们之前建立的乳腺上皮基因表达谱进行比较。通过基因本体（GO）分析对干细胞基因进行分类，并以单细胞分辨率分析干细胞群体中子集的表达。对不同乳腺癌队列和特定亚型中的干细胞基因激活情况进行调查，并测试其临床预后能力。

结果：鉴定出一组323个基因，与乳腺上皮的所有其他细胞相比，这些基因在纯化的基底干细胞中的表达显著更高。除我们自己的研究外，在323个基因中，总共有109个基因与干细胞特征相关，这为它们参与这种细胞类型的生物学研究提供了进一步的支持。GO分析表明，这些基因的富集与细胞迁移、细胞骨架调节和组织形态发生有关，与侵袭和转移的作用一致。单细胞分辨率分析表明，单个细胞同时表达上皮和间质相关基因/蛋白。最引人注目的是，我们证明了TNBC中这种干细胞基因集的强大活性可以识别出那些最有可能迅速进展为转移的肿瘤。

结论：我们的研究结果支持这样一种假设，即正常干细胞的生物学特性是转移的驱动因素，并且这些特性可以用于将患有高度异质性疾病（如TNBC）的患者分层。

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数字

图1
图1
高纯度基础乳腺干细胞的分离。（A、B）从8至10周龄的处女FVB小鼠分离并用抗CD24、Sca-1、CD49f和c-Kit的抗体染色的小鼠乳腺上皮细胞的流式细胞术。（A）如前所述，根据CD24和Sca-1表达以及c-Kit分离内质网前体细胞（Gate I）和内质网ER+细胞群（Gate II）[13]。（B）从与（A）根据CD24和CD49f的表达，然后使用前面描述的c-Kit[13]。仅显示上皮细胞数据。有关完整的选通层次结构，请参阅附加文件1。（C）乳腺上皮谱系特异性基因的qrtPCR基因表达分析。数据表示为每个细胞群的三个独立分离物中对照细胞群（管腔ER细胞）的平均倍数表达（±95%置信区间）。根据[74]确定统计显著性。** P（P）相对于比较器<0.01。”“典型表达”表示根据之前的研究结果，预期基因表达水平最高的人群[13]。§ Dmbt1型在MaSC和MYO群体的所有分离物中均未检测到表达。（D）将乳腺亚群低剂量移植到清除脂肪垫中的结果。如饼图符号所示，图中显示了成功的副生长数、移植的脂肪垫总数以及每个副生长填充脂肪垫的程度。雌激素受体；qrtPCR，定量实时rtPCR。
图2
图2
MaSC具有独特的基因表达谱。（A）MaSC、MYO、总基底层、管腔ER-（ER-）和管腔ER+（ER+）乳腺上皮亚群之间差异表达基因的无监督分层聚类热图。表达式值表示每个问题的以中位数为中心的值。（B）在MaSC、MYO、总基底细胞、ER和ER+人群中，69个MaSC顶级特征基因的微阵列表达数据的无监督分层聚类（表2）。（C）通过全转录组微阵列分析确定感兴趣的MaSC基因的qrtPCR验证。的表达式Cdh5、Gfra2、Krt15、Lgals1、Lgr5、Nfatc1、Pdgfb Prox1、Ptprb、Ptprz1、Tnc、Vim、Zeb1、Zeb2通过qrtPCR分析测定的管腔ER-、管腔ER+、MYO和MaSC未扩增RNA。数据表示为每个细胞群的三个独立分离物中对照细胞群（管腔ER细胞）的平均相对折叠表达（±95%置信区间）。根据[74]确定统计显著性。** P（P）<0.01;* P（P）<0.05; 相对于括号中第二高表达群体，N.S不显著。雌激素受体；MaSC，乳腺干细胞；肌上皮细胞；qrtPCR，定量实时rtPCR。
图3
图3
MaSC基因特征分析。（A）基于DAVID注释聚类的MaSC基因特征的GO生物过程分类明细（附加文件5）。（B-E）MaSC签名和已发布数据集之间重叠的VENNY分析[10-12,39,40]（附加文件6）。（B）与已发表的Stingl、Lim和Pece成人干细胞基因列表重叠。（C）与Wansbury胎儿乳腺芽上皮和Spike胎儿乳腺干细胞基因重叠。（D）与Wansbury胎儿乳腺肠系膜和Spike胎儿乳腺基质基因重叠。（E）与Spike胎儿和成人干细胞基因列表重叠。GO，基因本体论；MaSC，乳腺干细胞。
图4
图4
单个MaSC具有不同的基因表达模式。（A）单个细胞之间基因表达的变异系数是可变的，其中一些差异很大(克15,维姆)和其他更统一的(Pdgfb、Ptprb、Ptprz1). 数据以1/Ct值表示。（B）32个个体MaSC中12个基因的以中位数为中心的qrtPCR基因表达数据的无监督分层聚类。注意，在细胞之间的整个面板上，基因表达没有明显的相似块。MaSC，乳腺干细胞；qrtPCR，定量实时rtPCR。
图5
图5
MaSC群体不包含不同的亚群体。（A）单个细胞的基因表达谱之间的皮尔逊相关性表明细胞之间的基因表达相关性较低（有关详细信息，请参阅附加文件12）。（B）的比较维姆和克15qrtPCR检测单个MaSCs的基因表达。数据以1/Ct值表示。（C）K15单染和K15/Vim双染MaSC的示例。酒吧 = 10μm K15，角蛋白15；MaSC，乳腺干细胞；定量实时rtPCR；维姆，维门汀。
图6
图6
MaSC基因特征预测TNBC中DMFS显著缩短。Kaplan-Meier生存曲线显示三组TNBC和三组ER+乳腺癌的无远处转移生存率（DMFS）。分层基于与其他样本相比具有较高DART激活分数的前三分位样本，用于富集MaSC基因特征，但Guy’s107 TNBC数据集除外，该数据集使用激活分数中值作为边界进行分层。（A）卡恩579 TNBC[24]。（B）男子107 TNBC[25]。（C）莱曼TNBC[26]。（D）NKI295 ER+[28]。（E）GSE2990 ER+[30]。（F）TRANSBIG ER+[29]。基于关联网络拓扑的去噪算法；雌激素受体；MaSC，乳腺干细胞；TNBC，三阴性乳腺癌。
图7
图7
MaSC基因特征在类正常而非克劳丁低肿瘤中富集。METABRIC乳腺癌队列中乳腺癌MaSC基因特征的DART激活分数。将该队列划分为分子定义的乳腺癌亚型是基于其先前发布的PAM50质心相关性（上面板）（红色为类基底，粉红色为HER2，深蓝色为A管腔，浅蓝色为B管腔，绿色为正常）以及之前定义的10个IntClust亚组（下面板）。肿瘤数量显示在每个亚型下面。MaSC基因特征的DART激活分数显示在两个图的y轴上。基于关联网络拓扑的去噪算法；人表皮生长因子受体2；MaSC，乳腺干细胞。
图8
图8
MaSC基因特征在特定的TNBC亚型中具有预后能力。Karn579队列中MaSC基因特征的DART激活分数显示为（A）Lehmann TNBC亚型分类[26]。TNBC亚型表现为粉红色的基底样1（BL1）、蓝色基底样2（BL2）、橙色免疫调节（IM）、灰色间充质（M）、洋红间充质干样（MSL）、绿色腔雄激素受体（LAR）和（B）Burstein及其同事定义的TNBC亚型的质心分类[34]，即“腔雄激素受体（LAR）”、“间充质（MES）”、‘基础样免疫抑制（BLIS）’和‘基础样免疫力激活（BLIA）’组。MaSC DART分数显示在y轴上。（C）Karn队列的Kaplan-Meier分析根据Lehmann及其同事定义的六种TNBC亚型分层[33]。Kaplan-Meier分析显示了无事件生存率和随访信息。（D）BL1、，（E）BL2和（F）对Karn579数据中M类TNBC分别进行分析，并根据其MaSC DART评分活动的最高三分位数进行分层。基于关联网络拓扑的去噪算法；MaSC，乳腺干细胞；TNBC，三阴性乳腺癌。
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