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.2015年5月15日；75(10):2061-70.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-14-2564。 Epub 2015年4月2日。

KIT抑制胃肠道间质瘤MET信号转导的药理作用

诺亚·A·科恩 1, 单增 1, 阿德里安·塞弗特 1, 特蕾莎·S·金 1, 埃里克·索伦森 1, 乔纳森·格里尔 1, 迈克尔·贝克曼 1, 胡安·桑塔马里亚·巴里亚 1, 梅根·H·克劳利 1, 本杰明·L·格林 1, 费迪南德·罗西 1, 彼得·贝斯默 2, 克里斯蒂娜·安东尼斯库 三, 罗纳德·德·马特奥 4
附属公司

KIT抑制胃肠道间质瘤MET信号转导的药理作用

诺亚·A·科恩等。 癌症研究. .

摘要

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的成人肉瘤，致癌驱动因素通常是KIT或PDGFRA突变。尽管GIST最初通常对伊马替尼或其他酪氨酸激酶抑制剂敏感，但通常会产生耐药性，因此需要备用治疗策略。在这项研究中，我们确定了获得伊马替尼耐药性的人类GIST样本的一个子集获得了MET癌基因激活形式的表达。在GIST小鼠模型（KitV558del/+小鼠）中，伊马替尼治疗后MET激活也发生了，MET激活与肿瘤缺氧增加有关。体外伊马替尼治疗后，伊马替尼敏感性人GIST细胞系中也出现MET活化。克里佐替尼或RNA干扰对MET的抑制对伊马替尼耐药的人GIST细胞群具有细胞毒性。此外，在伊马替尼敏感的GIST模型中，克里佐替尼和伊马替尼比单独伊马替宁更有效。最后，卡波坦丁尼是一种双重MET和KIT小分子抑制剂，在伊马替尼敏感性和伊马替尼耐药性GIST的多个临床前模型中明显比伊马替宁更有效。总之，我们的研究结果表明，KIT抑制激活代偿MET信号可能有助于肿瘤抵抗。此外，我们的工作为卡波坦尼抑制MET作为GIST治疗的有效策略提供了临床前概念证明。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露

作者没有经济利益冲突。

数字

图1
图1。MET在人类GIST的一个子集中被激活
(A类)未经处理的GIST882、HG129和HG209细胞的磷酸RTK阵列密度测定。*，p<0.05，方差分析。(B类)定量RT-PCR遇见相对于GIST-T1细胞，伊马替尼敏感（敏感）和伊马替尼耐药（耐药）人类GIST细胞系中的mRNA表达。*，p<0.05，t吨-测试。(C类)GIST882和HG209细胞系的Western blot。(D类)未经处理（UT）、敏感（Sens.）或耐药的人类GIST标本的Western blot。使用Miettinen分类计算原发性胃GIST的临床风险评分（42）。提示来源于HG209细胞系的肿瘤标本(↑). (E类)Western blot和pMET:MET像素密度测定法，对使用对照药物或伊马替尼0.5µM治疗24小时的人GIST细胞系进行测定，代表3个独立实验。对于A、 C和E，细胞保存在无血清培养基中。棒材，平均值±SEM。
图2
图2。KIT抑制在GIST小鼠模型中诱导MET激活
(A类)配套元件V558del版/+用载体或伊马替尼治疗小鼠遇见定量RT-PCR检测mRNA表达。n=每组4-5只小鼠。*，p<0.05，t吨-测试。(B、 C类)配套元件V558del版/+用载体、伊马替尼或舒尼替尼治疗小鼠。(D类)MET表达的代表性FACS直方图（蓝色）与肿瘤内CD45的同种型（实心灰色）（左）和MET阳性百分比（右）的比较+，第45页−配套元件−和CD45+配套元件+未经处理的细胞配套元件V558del版/+小鼠肿瘤。*，p<0.05，方差分析。(E类)配套元件V558del版/+用载体或伊马替尼治疗小鼠2周，用ELISA测定肿瘤HGF浓度，并与载体治疗的小鼠进行比较配套元件V558del版/+小鼠肝脏。*，p<0.05，t吨-测试。(F类)配套元件V558del版/+对小鼠肿瘤进行治疗Hif1a型定量RT-PCR检测mRNA表达。n=每组4-5只小鼠。*，p<0.05，t吨-测试。(G公司)配套元件V558del版/+给小鼠治疗4周，然后在处死前1小时注射吡莫硝唑。肿瘤的典型免疫荧光图像。绿色，吡莫硝唑。蓝色，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）。比例尺，100µM。n=每组4只小鼠。棒材，平均值±SEM。
图3
图3。MET抑制增加伊马替尼在人GIST细胞系中的作用
(A类)用溶媒或HGF 100 ng/mL处理72小时后，血清缺乏的人GIST细胞系的细胞活力*，p<0.05，t吨-测试。(B类)在指定浓度下用伊马替尼或克雷佐替尼处理的HG209人GIST细胞系的细胞活力。使用非线性回归，IC50测定HG209的伊马替尼和克里佐替尼值（>1000 nM vs.109 nM）。(C类)用非靶控siRNA（Neg siRNA）或ON-target加SMARTpool siRNA（MET siRNA）转染HG209细胞。显示转染后72小时的细胞活力。*，p<0.05，t吨-测试。Western blot显示MET击倒效率。(D类)无菌水对照（CTRL）、HGF 100 ng/mL或伊马替尼50 nM（IM）处理GIST882细胞72小时后的细胞存活率*，p<0.05，t吨-测试。(E类)用二甲基亚砜对照（CTRL）、克唑替尼（Criz）或伊马替尼（IM）处理72小时的人GIST细胞系的存活率。*，p<0.05，方差分析。(F类)用非靶向对照siRNA（Neg siRNA）或ON-target加SMARTpool siRNA（MET siRNA）转染GIST882和GIST-T1细胞。然后用无菌水对照或伊马替尼0.1µM处理GIST882细胞48小时，用无菌水对照或伊马替尼0.05µM处理GIST-T1细胞48小时，并测量细胞活力。*，p<0.05，t吨-测试。Western blot显示MET击倒效率。(G公司)如图所示，将已建立HG129 s.q.异种移植物的NSG小鼠治疗42天。*，p<0.05，t吨-测试。n=每组4-5只小鼠。数据来自B、 C、D、E和F代表了≥3个独立实验。棒材，平均值±SEM。
图4
图4。MET抑制增加伊马替尼在配套元件V558del版/+老鼠
配套元件V558del版/+用载体（Veh）、伊马替尼（IM）或克里唑替尼（Criz）治疗小鼠2周，然后(A类)对肿瘤进行称重(B类)受到西方印迹的影响，以及(C类)KIT和Ki67的免疫染色。比例尺，100µM。数据代表了2个独立实验，每组5–7只小鼠。棒材，平均值±SEM.*，p<0.05。
图5
图5。Cabozantini是一种双重MET和KIT小分子抑制剂，对多种GIST临床前模型有效
(A类)伊马替尼或卡波坦丁尼在指定浓度下处理的人GIST细胞系的存活率。使用非线性回归，IC50计算GIST882（80 nM对30 nM）、GIST-T1（37 nM对15 nM）和HG129（38 nM对14 nM）细胞中伊马替尼和卡波坦尼的数值，以及HG209（10 nM）电池中卡波坦尼的数值。(B–E类)将已建立HG129或HG209皮下异种移植瘤的NSG小鼠治疗15天。显示了肿瘤的代表性大体外观（比例尺，1 cm）、肿瘤生长曲线以及代表性KIT和Ki67免疫组织化学（比例栏，100µM）。n=3-9只/组。(F类)配套元件V558del版/+给小鼠治疗2周，然后称重肿瘤（G）KIT、Ki67和CD31染色（代表性图像，比例尺，100µM）。每组n=6-7只小鼠。（H） 配套元件V558型号/+将小鼠治疗8周，并对肿瘤进行KIT和Ki67染色（代表性图像，比例尺，100µM）。n=2只/组。数据来自A、 F类和G公司是3个独立实验的代表。棒材，平均值±SEM.*，p<0.05。
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