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.2015年4月1日；35(13):5221-32.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4650-14.2015。

介导α-突触核蛋白神经毒性的分子途径的定义

杰奎琳·伯雷 1, 曼鲁·夏马 2, 托马斯·苏多夫 三
附属公司

介导α-突触核蛋白神经毒性的分子途径的定义

杰奎琳·伯雷等。 神经科学. .

摘要

α-突触核蛋白生理伴侣在突触处合成SNARE-复合物，但在病理上错误地折叠成神经毒性聚集物，这是神经退行性疾病（如帕金森氏病）的特征，并可能在帕金森氏症发病过程中从一个神经元向另一个神经元扩散。在正常神经末梢中，α-突触核蛋白存在于细胞溶质形式（天然展开和单体）和膜结合形式（由α-螺旋多聚物组成，伴随SNARE-复合物组装）之间的平衡中。虽然α-突触核蛋白的神经毒性已经得到了很好的证实，但α-突触核蛋白的天然构象与其病理聚集之间的关系仍不完全清楚；最重要的是，尚不清楚α-突触核蛋白的聚集是源于其单体细胞溶质形式还是寡聚膜结合形式，我们通过引入阻断膜结合的α-突触核蛋白点突变来解决这个问题，然后评估阻断膜结合对α-突触核蛋白聚集和神经毒性的影响。我们表明，膜结合抑制α-突触核蛋白聚集；相反，阻断膜结合增强了α-突触核蛋白的聚集。小鼠黑质中野生型和突变型α-突触核蛋白的立体定向表达表明，阻断α-突触核蛋白膜结合可显著增强其体内神经毒性。我们的数据描绘了α-突触核蛋白的折叠途径，从生理上的多聚体、α-螺旋和膜结合物种，在单体、天然未折叠的形式上充当SNARE复合物伴侣，到体内具有神经毒性的淀粉样聚集体。

关键词：帕金森病；聚集；α-突触核蛋白；膜结合。

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数字

图1。
图1。
α-突触核蛋白脂质结合缺陷突变体的设计。A类，α-突触核蛋白结构域结构（红色，脂质结合域；蓝色，蛋白质相互作用域），脂质结合缺陷突变标记为红色，11-mer序列用黑箱突出显示。B类纯化重组突变体α-突触核蛋白（5μg/lane）的SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色。C类,D类，野生型和突变型α-突触核蛋白的脂质结合。C类，重组α-突触核蛋白与带负电荷的脂质体（组成：30%磷脂酰丝氨酸（PS）和70%磷脂酰胆碱（PC））孵育并进行浮选分析。从浮选梯度的顶部到底部收集八个组分，用SDS-PAGE和免疫印迹法分离等体积的每个组分。D类，前两个组分被定义为脂结合组分，并以总α-突触核蛋白的百分比进行量化（平均值±SEM**第页<0.001作者：Mann–WhitneyU型测试；n个=3）。E类，分析α-突触核蛋白突变对膜结合诱导的α-突触核蛋白多重聚合的影响。重组α-突触核蛋白与带负电荷的脂质体（组成：30%PS，70%PC）孵育，并暴露于浓度增加的化学交联剂戊二醛（浓度：0–0.5%）。通过免疫印迹分析等体积交联蛋白。箭头表示α-突触核蛋白多聚体。
图2。
图2。
α-突触核蛋白的聚集在体外.A类,B类在37°C和300 rpm的条件下，在缓冲液（左侧面板）或带电脂质体（成分：30%PS，70%PC；右侧面板）中培养无法与脂质体结合的重组野生型α-synuclein或突变型α-sunuclein。在指定的时间点，通过光学显微镜评估α-突触核蛋白的聚集。
图3。
图3。
体外α-synuclein（α-Syn）的聚集。A类,B类α-突触核蛋白的淀粉样形成。如图2所示，培养重组α-突触核蛋白。在指定的时间点，分析野生型和突变型α-突触核蛋白在缓冲液中的淀粉样纤维形成(A类)或在带电脂质体存在下(B类)使用染料K114（平均值±SEM*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001作者：Mann–WhitneyU型测试；##第页< 0.01,###第页通过双向方差分析<0.001；n个= 7; 不另作说明，不重要）。C类,D类，α-突触核蛋白单体损失分析。在指定的时间点，通过免疫印迹法分析聚集在缓冲液或带电脂质体中的相同体积的野生型和突变型α-突触核蛋白，并量化单体损失（平均值±SEM**第页<0.01，作者：Mann–WhitneyU型测试；###第页双向方差分析<0.001；n个= 7; 不另作说明，不重要）。E类，凝胶过滤法分析野生型和突变型α-突触核蛋白。在指定的时间点，通过凝胶过滤分析90μl聚集重组野生型和突变型α-突触核蛋白。为了避免凝胶过滤柱堵塞，在装载之前通过离心法去除可见的聚集物。
图4。
图4。
α-突触核蛋白在HEK293T细胞中的聚集和毒性。A类,B类，用编码野生型和突变型α-突触核蛋白的等量表达载体转染的HEK293T细胞中野生型和突触型α-联核蛋白的聚集。A类转染后2天，细胞固定，并用myc表位抗体进行免疫染色。B类，量化每个字段的免疫阳性聚集物数量，并与野生型水平进行比较（平均值±SEM***第页<0.001作者：Mann–WhitneyU型测试；n个=3种独立文化）。C类,D类，野生型和突变型α-突触核蛋白（α-Syn）在HEK293T细胞中的表达。转染后两天，用抗myc表位抗体的免疫印迹法分析表达水平(C类)，归一化为β-肌动蛋白水平，并量化为野生型水平的百分比(D类; 指±SEM；n个=4种独立文化）。E类，转染野生型和突变型α-突触核蛋白的HEK293T细胞的代谢活性。转染两天后，对细胞进行MTT分析。数据归一化为野生型α-突触核蛋白水平（平均值±SEM*第页<0.05由Mann–Whitney提供U型测试；n个=6种独立文化）。
图5。
图5。
N2a神经母细胞瘤细胞中α-突触核蛋白的聚集和毒性。A类，野生型和突变型α-突触核蛋白在N2a神经母细胞瘤细胞中的表达。转染后两天，细胞被固定，并用myc表位抗体进行免疫染色。使用DAPI对细胞核进行可视化。B类,C类，野生型和突变型α-突触核蛋白（α-Syn）在N2a神经母细胞瘤细胞中的表达。转染后两天，用myc表位抗体进行免疫印迹分析表达水平(B类)，归一化为β-肌动蛋白水平，并量化为野生型水平的百分比(C类; 指±SEM；n个=6种独立文化）。D类，转染野生型和突变型α-突触核蛋白的N2a神经母细胞瘤细胞的代谢活性。转染后两天，对细胞进行MTT测定。数据归一化为野生型α-突触核蛋白水平（平均值±SEM*第页< 0.05, **第页<0.01，作者：Mann–WhitneyU型测试；n个=6种独立文化）。
图6。
图6。
多巴胺能黑质神经元野生型和突变型α-突触核蛋白的慢病毒表达。A类，立体定向注射实验示意图概述。对野生型小鼠（40–45天龄）进行立体定向和单侧黑质注射（左）。注射后10至45天，每5天监测一次小鼠，然后处死小鼠进行组织化学分析（右）。B类,C类，光束分析。B类，使用束走任务分析运动缺陷，在束走任务中测量脚在束走上的滑移。每节课分析三轮束流行走。记录平均脚滑。C类，注射后45天平均脚滑的定量。数据为平均值±SEM(*,#第页<0.05，作者：Mann–WhitneyU型测试；n个=5只小鼠）。
图7。
图7。
注射表达α-突触核蛋白变体的慢病毒颗粒的小鼠的运动损伤。A类，力板分析的代表性痕迹。按照图5所示对小鼠进行注射和分析。B–I类，分析空间限制、总距离和连续距离以及低机动性发作，根据多只相同注射小鼠获得的力板数据进行计算。每5天，对小鼠进行行为分析(B类,D类,F类,H（H）)，数据绘制为注射后45天的差异(C类,E类,G公司,我). 数据为平均值±SEM(*,#第页< 0.05, **,##第页<0.01，作者：Mann–WhitneyU型测试；n个＝5只小鼠）。
图8。
图8。
黑质中表达α-突触核蛋白（αSyn）突变体的小鼠的神经元损失。A类,C类将表达野生型或突变型α-突触核蛋白的慢病毒（对照）或慢病毒立体定向和单侧注射到40至45日龄小鼠的黑质中。注射45天后，对注射区域进行酪氨酸羟化酶（TH；左侧）或NeuN（右侧）和DAPI（蓝色）免疫染色。IRES驱动的GFP标记注射部位。B类,D类，通过TH免疫染色定量多巴胺能神经元的密度(B类)NeuN阳性（非多巴胺能）神经元的密度通过NeuN的免疫染色进行定量(D类). 数据为平均值±SEM(*,#第页<0.05，作者：Mann–WhitneyU型测试；n个=5只小鼠）。
图9。
图9。
与生理功能和病理活动相关的α-突触核蛋白构象示意图。可溶性α-突触核蛋白是天然的非结构和单体。在与高度弯曲的膜（如突触囊泡）结合后，α-突触核蛋白发生构象变化，折叠成断裂的两性α-螺旋，这与多重聚合有关，并介导其SNARE复合物伴侣功能。在病理条件下，可溶性α-突触核蛋白形成β-片状低聚物（原纤维），转化为淀粉样纤维，最终沉积到路易小体中。在帕金森病和路易体痴呆中，原纤维和原纤维可能从神经元传到神经元，在多系统萎缩中可能从胶质细胞传到胶质细胞。
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