Serum- and Glucocorticoid-Inducible Kinase 1 Confers Protection in Cell-Based and in In Vivo Neurotoxin Models via the c-Jun N-Terminal Kinase Signaling Pathway

doi:10.1128/MCB.01510-14

.2015年6月1日；35(11):1992-2006.

doi:10.1128/MCB.01510-14。 Epub 2015年3月30日。

血清和糖皮质激素诱导激酶1通过c-Jun N-末端激酶信号通路在细胞和体内神经毒素模型中提供保护

莎拉·伊克巴尔¹, 香农霍华德¹, 菲利普·洛格拉索²

附属公司

¹美国佛罗里达州朱庇特斯克里普斯研究所分子治疗与转化研究所。
²美国佛罗里达州朱庇特斯克里普斯研究所分子治疗与转化研究所lograsso@scripps.edu。

PMID： 25825522
预防性维修识别码：项目经理4420923
内政部： 10.1128/MCB.01510-14

血清和糖皮质激素诱导激酶1通过c-Jun N-末端激酶信号通路在细胞和体内神经毒素模型中提供保护

莎拉·伊克巴尔等。分子细胞生物学. 2015.

.2015年6月1日；35(11):1992-2006.

doi:10.1128/MCB.01510-14。 Epub 2015年3月30日。

作者

莎拉·伊克巴尔¹, 香农霍华德¹, 菲利普·洛格拉索²

附属公司

¹美国佛罗里达州朱庇特斯克里普斯研究所分子治疗与转化研究所。
²美国佛罗里达州朱庇特斯克里普斯研究所分子治疗与转化研究所lograsso@scripps.edu。

PMID： 25825522
预防性维修识别码：项目经理4420923
内政部： 10.1128/MCB.01510-14

摘要

血清糖皮质激素激酶1（SGK1）已被证明在帕金森病模型中具有保护作用，但其带来益处的细节尚不清楚。本研究旨在研究SGK1提供神经保护的细节。为此，我们采用细胞神经退行性变模型来研究6-羟基多巴胺诱导的c-Jun N-末端激酶（JNK）信号传导和内质网（ER）应激。建立SGK1表达腺病毒，用于SH-SY5Y细胞中SGK1的过度表达，并使用地塞米松增加SGK1内源性表达。监测氧化应激、线粒体功能障碍和细胞死亡，以测试SGK1的保护作用。为了研究SGK1在体内过度表达的影响，将表达SGK1的腺病毒注射到经1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶处理的小鼠纹状体中，并通过酪氨酸羟化酶免疫组织化学定量评估其对多巴胺能神经元的保护作用。SGK1过表达可通过灭活丝裂原活化蛋白激酶激酶4（MKK4）、JNK和糖原合成酶激酶3β（GSK3β），从而降低ER和氧化应激，从而降低体内外活性氧生成，减轻线粒体功能障碍，挽救细胞死亡。这些结果表明，激活SGK1的治疗策略可能通过阻断JNK和GSK3β通路而具有神经保护作用。

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数字

图1
SGK1在神经毒性应激反应中上调，地塞米松诱导其过度表达可挽救6-OHDA介导的SH-SY5Y细胞的细胞死亡和线粒体功能障碍。（A） SGK1 mRNA表达谱显示，35μM 6-OHDA治疗后，随着时间的推移，SGK1的表达增加。（B） Western免疫印迹分析表明，内源性SGK1表达上调，SGK1被磷酸化以响应细胞应激，例如6-OHDA诱导的应激。在6-OHDA处理前24小时，通过向SH-SY5Y细胞中添加10μM地塞米松（Dex）诱导（C、D和E）SGK1表达。6-OHDA（35μM）用于诱导线粒体功能障碍和细胞死亡。监测SH-SY5Y细胞线粒体超氧化物生成（C）、膜去极化（D）和细胞死亡（E），并比较SGK1和选择性JNK抑制剂的保护作用。（F）使用变构Akt抑制剂MK-2206。DMSO被用作小分子对照。此图中的数据表示三个生物复制品的测量值，每个复制品三个样本。统计显著性(*P（P）*<0.05）使用Student’st吨测试。6-OHDA处理细胞和模拟或Dex处理细胞的值之间的差异用一个星号表示。6-OHDA和Dex+6-OHDA治疗组或6-OHDA与Dex+Akt抑制剂+6-OHDA治疗组之间的数值差异用双星表示。MW，分子量（单位：千）。

图2
腺病毒介导的SGK1过度表达挽救了6-OHDA诱导的线粒体超氧化物生成、膜去极化和细胞死亡。SH-SY5Y细胞在MOI为5的条件下用AdV-SGK1感染，并在37°C和5%CO下孵育₂蛋白表达48小时。然后用35μM 6-OHDA处理细胞5 h。将模拟绿色荧光蛋白感染的细胞用作细胞背景对照，而DMSO用作小分子对照。通过线粒体SOX红染色监测活细胞成像（A）和定量测量（B）的线粒体超氧化物生成。JC-1染色检测线粒体膜去极化（C），MTT细胞活力测定（D）检测细胞死亡。所提供的数据代表三个生物复制品的测量结果，每个复制品三个样本。统计显著性(*P（P）*<0.05）使用Student’st吨测试。6-OHDA处理的细胞和模拟或AdV-SGK1处理的细胞的值之间的差异用一个星号表示，6-OHDA和AdV-SGK1加6-OHDA治疗组或6-OHDA与AdV-SGK加Akt抑制剂加6-OHDA治疗组之间的值差异用两个星号显示。

图3
SGK1的过度表达可挽救6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞应激标记蛋白的表达。用AdV-SGK1感染SH-SY5Y细胞或用10μM地塞米松（Dex）诱导SGK1表达，并检测细胞裂解液中BiP（A）、Hsp70（B）和SOD1（C）的表达，如图所示。α-管蛋白被用作负荷控制。在用500nM JNK抑制剂SR-3306处理的6-OHDA处理的细胞中也监测了BiP、Hsp70和SOD1的表达。表达绿色荧光蛋白的腺病毒被用作AdV-SGK1感染的对照。这里提供的数据是三个生物复制品的代表性蛋白质印迹。

图4
过表达SGK1的细胞中SGK1底物NDRG-1和FoxO3a磷酸化的免疫印迹分析。将SH-SY5Y细胞感染AdV-SGK1并孵育48小时，以进行材料和方法中所述的蛋白表达。α-管蛋白显示为一种负载控制。所提供的数据是来自三个生物复制品的代表性蛋白质印迹。MW，分子量（单位：千）。

图5
SGK1通过灭活SH-SY5Y细胞中的GSK3β，挽救了细胞生存蛋白Mcl-1的降解及其磷酸化。在不同的细胞处理条件下测定如下比率，如图所示：GSK3β（Ser390）磷酸化/α-微管蛋白水平（A）、磷酸化GSK3β（Ser9）/α-微管蛋白水平（B）、Mcl-1/α-微管蛋白水平（C）和磷酸化Mcl-1/α-微管蛋白水平（D）。细胞要么未经处理，要么未经治疗并感染AdV-SGK1，要么用PBS和35μM 6-OHDA处理，要么用35μM 6-OHDA处理并感染AdV SGK1。

图6
在6-OHDA存在和不存在的情况下，SGK1表达对MKK4、MKK7和JNK磷酸化状态的影响*在体外*（A）在1μM ATP存在下，使用0.75μM活性SGK1蛋白和不同浓度的非活性MKK4（0至10μM）进行Kinase-Glo分析。MKK7蛋白在本试验中用作阴性对照，正如预期的那样，在存在活性SGK1和ATP的情况下没有磷酸化。（B）在1μM和10μM ATP存在下，活性SGK1在丝氨酸80上磷酸化MKK4的Western免疫印迹分析。（C到F）使用未经处理的SH-SY5Y细胞和在AdV-SGK1存在和不存在的情况下用35μM 6-OHDA处理的SH-SY5Y细胞进行免疫印迹分析，以确定以下比率：磷酸化-MKK4（Ser257/Thr261）/α-微管蛋白（C）、磷酸化-MKK4（Ser80）/α-tubulin。MKK4、MKK7和JNK的表达水平在不同处理之间没有显著变化（数据未显示）。

图7
28天后，YFP-SGK1在SNpc中过度表达。将AdV-YFP-SGK1注射到经生理盐水或MPTP处理的小鼠纹状体中，28天后检测YFP-SG K1的表达。TH免疫组织化学显示，一只典型的盐处理小鼠和一只MPTP处理小鼠在MPTP治疗前21天AdV-SGK1过度表达。总计1×10¹⁰在18 mg/kg MPTP急性治疗方案（每2小时1次，共4次）前21天，将AdV-SGK1病毒颗粒注入纹状体。

图8
SGK1过表达通过抑制MKK4介导的JNK活化，保护了MPTP诱导的C57BL/6J小鼠黑质多巴胺能神经元死亡。（A）在MPTP治疗前21天，AdV-SGK1过度表达的代表性盐处理小鼠、MPTP处理小鼠和MPTP处理鼠的TH免疫组织化学。总计1×10¹⁰在18 mg/kg MPTP急性治疗方案（每2小时1次，共4次）前21天，将AdV-SGK1病毒颗粒注入纹状体。（B）不同治疗组TH阳性神经元的体视量化（i）和用于TH神经元分析的中脑切片测量体积（ii）。ISI，同侧；IP，腹腔注射。*，*P（P）*生理盐水+生理盐水或AdV-SGK1+生理盐水和生理盐水+MPTP之间均<0.01；**，*P（P）*生理盐水+MPTP和Adv-SGK1+MPTP之间的差异<0.01。（C）对经生理盐水、生理盐水/MPTP和MPTP/AdV-SGK1处理的中脑进行磷酸化-SGK1、磷酸化-MKK4（Ser257/Thr261）、磷酸化MKK4、磷酸化JNK和磷酸化C-Jun的免疫印迹分析（i）。对这些蛋白质的表达进行量化，并将其归一化为相应处理的α-微管蛋白的表达（ii）。

图9
C57BL/6J小鼠黑质磷酸化c-Jun（p-c-Jun）免疫组化分析。p-c-Jun免疫组织化学（红色）显示了一只典型的盐处理小鼠、一只MPTP处理小鼠和一只MPTP-处理小鼠，其中AdV-SGK1在MPTP治疗前21天过度表达。TH免疫组织化学（绿色）显示了一只典型的盐处理小鼠、一只MPTP处理小鼠和一只MPTP-处理小鼠，其中AdV-SGK1在MPTP治疗前21天过度表达。总计1×10¹⁰AdV-SGK1的病毒颗粒在18mg/kg MPTP的急性治疗方案（每2小时1剂，4剂）前21天注射到纹状体中。

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