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.2015年3月30日；10（3）：e0122308。
doi:10.1371/journal.pone.0122308。 2015年电子收集。

线粒体动力学蛋白Drp1在嗜酸细胞甲状腺肿瘤中过度表达并调节癌细胞迁移

安德烈·费雷拉·达·席尔瓦 1, 克里斯蒂娜·瓦拉卡 2, 伊丽莎白·里奥斯 三, 海伦娜·波普洛 4, 保拉·索尔斯 1, 曼努埃尔·索布林霍·西姆斯 三, 卢卡·斯科拉诺 5, 瓦尔德马尔·马西莫 1, 西尔维娅·坎佩罗 6
附属公司

线粒体动力学蛋白Drp1在嗜酸性甲状腺肿瘤中过表达并调节癌细胞迁移

安德烈·费雷拉·达席尔瓦等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

溶瘤细胞瘤的特征是细胞内形态异常的线粒体堆积，这表明线粒体生物发生异常在溶瘤细胞转化中起作用。目前对堆积线粒体形态异常的原因知之甚少。调节线粒体形态的蛋白质，即“线粒体形成”蛋白质，可以调节其大小和数量；然而，迄今为止，尚不清楚线粒体动力学可能参与肿瘤嗜酸细胞转化。我们的目的是评估线粒体形态的状态及其在嗜酸细胞转化中的作用。因此，我们评估了一系列甲状腺细胞肿瘤样本以及具有和不具有嗜酸细胞特征的甲状腺肿瘤细胞系中主要线粒体融合和裂变蛋白的表达模式。采用免疫组织化学（IHC）方法对88例人类甲状腺肿瘤中线粒体融合蛋白（Opa1、Mfn1和Mfn2）和分裂蛋白（Drp1和Fis1）的表达进行了评估。为了进行比较和深化研究，使用TPC1（一种源自甲状腺乳头状癌的细胞系）和XTC进行了体外研究。UC1，一种嗜酸细胞滤泡性甲状腺癌衍生细胞系。IHC和体外蛋白分析均显示，嗜酸细胞性甲状腺肿瘤中“线粒体成形”蛋白的水平总体增加。此外，发现前表达蛋白Drp1的过度表达与恶性嗜酸细胞甲状腺肿瘤有关。有趣的是，Drp1活性的遗传和药理阻断能够影响甲状腺癌细胞的迁移/侵袭能力，这是肿瘤恶性的一个特征。在本研究中，我们发现线粒体动力学不平衡是甲状腺嗜酸细胞肿瘤恶性特征的特征，并参与迁移表型的获得。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：合著者卢卡·斯科拉诺（Luca Scorrano）不再是《公共科学图书馆·综合》（PLOS ONE）编辑委员会成员，因为他在作者提交的日期之前已经辞职。因此，没有什么能改变作者对《公共科学图书馆·综合》编辑政策和标准的遵守。

数字

图1
图1。线粒体成形蛋白的表达水平分析显示，与非嗜酸细胞肿瘤相比，嗜酸细胞甲状腺肿瘤的总体增加。
显示正常甲状腺组织（NT）和嗜酸细胞滤泡腺癌（A）、嗜酸细胞乳头状甲状腺癌（B）和非嗜酸细胞甲状腺癌变种（C）的肿瘤组织中Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1和Fis1抗体免疫染色的代表性显微照片放大300倍。插图中的黑色箭头表示染色的测量肿瘤区域，从noFVPTV到oFA，最后到oFTC的梯度增加。”#Mfn1-Mitofusin 1、Mfn2-Mitofussin 2、Opa1-视神经萎缩1、Drp1-Dynamin相关蛋白1、Fis1-线粒体分裂1蛋白。
图2
图2。Drp1表达显著增加与恶性嗜酸细胞甲状腺肿瘤相关。
评估Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1和Fis1的免疫染色，同时考虑所有甲状腺肿瘤（A和B）、单核细胞甲状腺肿瘤（C）或单核细胞非甲状腺肿瘤（D）。按照材料和方法中的描述计算平均抗原表达。结果显示为平均得分±SEM。*p<0.05（未配对t检验）。#Mfn1-Mitofusin 1、Mfn2-Mitofussin 2、Opa1-视神经萎缩1、Drp1-Dynamin相关蛋白1、Fis1-线粒体分裂1蛋白。
图3
图3。体外嗜酸细胞XTC线粒体的特征。UC1和非嗜酸细胞TPC1细胞系。
线粒体裂变蛋白在嗜酸细胞癌细胞中过度表达，Drp1在线粒体上积极积累。（A和B）XTC蛋白提取物中Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1和Fis1表达水平的代表性western blot分析。UC1和TPC1显示线粒体裂变蛋白的过度表达和融合前Mfn1的下调。Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1和Fis1的水平通过对照蛋白水平（TOM-20）进行量化和标准化。结果显示为至少三个独立实验的平均表达值±SEM。*p<0.05（未配对t检验）。（C） XTC中Drp1 mRNA水平相似。UC1和TPC1细胞系。通过qPCR检测XTC中Drp1、Fis1、Mfn2、Mfn 1和Opa1的mRNA水平。UC1和TPC1细胞系。结果表示为每个单个基因在细胞系之间归一化为各自的控制蛋白（肌动蛋白）的相对表达。结果显示为至少三个独立实验的平均表达值。误差条代表SEM。*p<0.05（未配对t检验）。（D） Drp1在XTC的线粒体处积极积累。UC1细胞系。两种XTC中均显示了重膜组分和细胞溶质组分的等蛋白提取物的代表性western blot分析。UC1和TPC1细胞系。（E和F）-线粒体网络在XTC几乎一半的细胞群中支离破碎。UC1.XTC的典型共焦图像。转染线粒体靶向RFP（mtRFP）的UC1和TPC1细胞系在XTC中显示线粒体断裂。基本条件下的UC1和TPC1。XTC公司。与TPC-1相比，UC1细胞系显示线粒体网络碎片化的细胞数量增加了4倍。线粒体碎片细胞的数量通过每个场至少计数30个细胞来量化。结果显示为至少三个独立实验的平均表达值±SEM。*p<0.05。#Mfn1-Mitofusin 1、Mfn2-Mitofussin 2、Opa1-视神经萎缩1、Drp1-Dynamin相关蛋白1、Fis1-线粒体分裂1蛋白和线粒体外膜TOM20-转位酶20 kDa。XTC公司。UC1-嗜酸细胞滤泡癌，TPC1-乳头状甲状腺癌衍生细胞系。（G和H）电子显微镜显示XTC中的线粒体明显较小。UC1.XTC的典型电子显微镜图像。显示UC1和TPC1细胞，总放大倍数为5800x。黑色箭头表示大小不同。XTC的线粒体大小低于2.5倍。UC1大于TPC1。通过测量每个细胞至少15个线粒体的外轮廓来估计线粒体面积。每个样本至少随机使用5个不同的细胞进行尺寸估计。结果显示为至少三个独立实验的平均表达值±SEM。*p<0.05。#XTC公司。UC1-嗜酸细胞滤泡癌，TPC1-乳头状甲状腺癌衍生细胞系。
图4
图4。Drp1的药理和基因阻断可防止嗜酸细胞迁移/侵袭。
（A） XTC公司。跨阱分析显示UC1细胞具有较高的基础迁移能力。每个载玻片至少有5个不同的视野，每个实验环境重复三次。（B） 在创伤愈合试验中，药物阻断Drp1可显著抑制嗜酸细胞（XTC.UC1）的迁移。在XTC中进行的15小时伤口愈合分析中，在指定的时间点（每1小时）获得的代表帧。UC1未经处理，XTC。UC1+DMSO和XTC。此处显示UC1+Mdivi1（一种特定的Drp1抑制剂）细胞。结果显示为至少三个独立实验的平均表达值±SEM。*配对样本t检验表示p<0.05。（C） 药理或基因阻断的Drp1导致XTC降低。跨阱分析中的UC1细胞迁移/侵袭能力。在12小时时间点跨阱分析结束时拍摄的代表性图像显示，通过基因（XTC.UC1+dnDRP）和药理（XTC.U1+Mdivi1）抑制Drp1处理的细胞的迁移/侵袭能力降低。条件：XTC。UC1未经处理，GFP转染XTC。UC1（作为转染对照），GFP+dnDRP联合转染XTC。UC1、XTC。UC1+DMSO（作为药物阻断控制）和XTC。UC1+Mdivi1（一种特殊的Drp1抑制剂）。结果显示为至少三个独立实验的平均表达值±SEM。*配对样本t检验p<0.05。#XTC公司。UC1-嗜酸细胞滤泡癌；绿色荧光蛋白；dnDRP-显性阴性形式的动力蛋白相关蛋白1（Drp1）Drp1-K38A；二甲基亚砜；线粒体分裂选择性细胞渗透抑制剂Drp1。
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出版物类型

赠款和资金

本研究部分得到了项目PIC/IC/83037/2007（致VM）、AIRC项目MFAG-12120和意大利卫生部项目GR-2011-02351643（致SC）的支持。进一步的资金来源于IPATIMUP的“微环境、代谢和癌症”项目，该项目得到了北区行动计划（ON.2-O Novo Norte）的部分支持，在国家咨询中心（QREN）下，通过欧洲区域基金会（FEDER）。IPATIMUP是葡萄牙科学、技术和高等教育部的一个联合实验室，由葡萄牙科学技术基金会（FCT）提供部分支持。该研究也是通过AFS博士学位授予的FCT（参考号：SFRH/BD/39104/2007）。