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.2015年3月30日：6:6533。
doi:10.1038/ncomms7533。

Cmr1/WDR76定义了连接基因组完整性和蛋白质质量控制的核基因毒性应激体

艾琳·加利纳 1, 卡米拉制冷 1, 彼得·亨里克森 2, 佩特拉·贝利 2, 中村京介 三, 朱迪思·奥夫曼 4, 大卫·P·马蒂亚森 1, 索尼娅·席尔瓦 1, 伊娃·霍夫曼 4, 安贾·格罗斯 三, Chunaram Choudhary公司 2, 迈克尔·利斯比 1
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Cmr1/WDR76定义了连接基因组完整性和蛋白质质量控制的核基因毒性应激体

艾琳·加利纳等。 国家公社. .

摘要

DNA复制应激是基因组不稳定的一个来源。在此，我们确定突变率变化1（Cmr1）是参与酿酒酵母对DNA复制应激反应的一个因素，并表明，Cmr1与Mrc1/Claspin、Pph3、含有TCP1（CCT）和25个其他蛋白质的伴侣蛋白一起，定义了一个新的核内质量控制室（INQ），该室可隔离错误折叠，泛素化和琥珀酰化蛋白对基因毒性应激的反应。定位于INQ的蛋白质的多样性表明，诸如细胞周期进展、染色质和有丝分裂纺锤体组织等其他生物过程也可能通过INQ进行调节。与Cmr1类似，其人类同源基因WDR76通过重新定位到核病灶并与CCT物理关联，对蛋白酶体抑制和DNA损伤作出反应，表明其具有进化保守的生物学功能。我们认为，Cmr1/WDR76通过调节氨酰化和磷酸化蛋白质的周转，在基因毒性应激的恢复中发挥作用。

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数字

图1
图1。Cmr1与RPA结合染色质相关。
(一)用于基于SILAC的与DNA修复因子相关的蛋白质复合物鉴定的工作流的表示。表达YFP标记（IG54-11D和IG46-1B）或未标记（IG45-8A）蛋白的酵母菌株在SILAC培养基中培养，并在用DNA损伤剂处理后以对数期收获。用GFP-Trap分别亲和纯化SILAC裂解产物中的蛋白复合物。蛋白质经胰蛋白酶蛋白水解，肽经液相色谱（LC）-MS/MS鉴定(b条)Rfa1-YFP和Rad52YFP相互作用蛋白的鉴定。该图显示了来自GFP标记的诱饵与来自正向和反向（SILAC标记交换）实验的对照的对数（10）SILAC比率。点表示已识别的蛋白质。Cmr1以红色突出显示，Rfa1和Rad52的一些已知交互作用物在相应的图中以黑色表示。(c（c）)Cmr1相互作用蛋白的鉴定。采用Cmr1-YFP（IG71-2B）作为引诱剂；Cmr1以红色突出显示；CCT-伴侣蛋白复合物亚基和Rfa1以黑色表示。(d日)Cmr1重定标至病灶。显示了未经处理和MMS处理的细胞的代表性图像。箭头表示选定的焦点。比例尺，2 微米。(e（电子）)Cmr1病灶的量化。在IG66中用荧光显微镜检查Cmr1-YFP定位。细胞生长到指数期，并在用佐菌素（200 微克 毫升−1)、MMS（0.05%）、CPT（5 微克 毫升−1)，4-NQO（0.2 微克 毫升−1)，HU（200 mM），EMS（0.5%）2 h、 或1 紫外线照射后h（25 J型 米−2). 误差线代表95%的置信区间。对每种情况下100-200个细胞的两到三个重复进行分析。(如果)hMLH1表达导致Cmr1病灶积聚。用pEH333转化表达Cmr1-YFP（IG66）的细胞，以异位表达hMLH1或用空载体（pEH334）。误差线代表95%的置信区间。对每个菌株的100-200个细胞的两到三个重复进行分析。
图2
图2。Cmr1定位于核周病灶。
(一)Cmr1病灶位于核周边。表达Cmr1-YFP（IG66）的细胞用pNEB21转化表达Nup49-CFP，用pML84转化表达NLS-yEmRFP，并用0.05%MMS处理。Cmr1相对于核质和核膜的定位显示在未叠置（G1）和成芽（S/G2）细胞中。核变焦为150%。(b条)α因子受体细胞中的Cmr1病灶。细胞（IG66）与α因子培养1 h、 然后用0.05%MMS治疗2次 小时(c（c）)Cmr1病灶的量化。在用0.05%MMS治疗1个月之前和之后，在异步和G1停滞的群体中量化具有Cmr1 YFP病灶的细胞（IG66）的百分比 h、 以及30、60和90 药物取出后分钟。对每种情况下100-200个细胞的两到三个重复进行分析。误差线代表95%的置信区间。(d日)Cmr1和截断构造的示意图。(e（电子）)Cmr1的WD40域对于重新定位到焦点是必要的和足够的。从含有NLS-yEmRFP的细胞（ML657）中的2μm质粒表达含有全长蛋白（pIG13）、N末端（pIG14）或含有WD40的蛋白部分（pIG15）的Cmr1-YFP构建物，并在0.05%MMS治疗后监测Cmr1在核病灶中的重定位。比例尺，2 微米。
图3
图3。INQ特性。
(一)Cmr1共定位蛋白的全基因组分析。表达GFP标记的查询蛋白和作为核标记物的Rad52-RFP（IG72-5C）的单倍体细胞通过高含量荧光显微镜成像，未经处理或处理2 小时，75 微克 毫升−1MG132。进一步测试重新定位到核周病灶的蛋白质与Cmr1的共同定位。列出了确认的共定位蛋白质。MMS处理后与Cmr1共定位的蛋白质以粗体突出显示。(b条)Cmr1病灶是由蛋白酶体功能的遗传损伤引起的。用高含量荧光显微镜对表达Cmr1-YFP和NLS-yEmRFP的基因缺失菌株进行成像。与野生型相比，自发性Cmr1病灶百分比增加了三倍以上的菌株被手动重新测试。图中只报告了产生与野生型显著不同结果的突变体(arp6Δ,slx1Δ,fpr1Δ,whi2Δ,sgs1Δ和csm2Δ)在屏幕上显示Cmr1-YFP病灶水平升高，但在手动重新测试中未显示。红色和蓝色虚线分别表示自动和手动分析的三重阈值。IG66作为手动重新测试的野生型参考菌株。(c（c）)Cmr1病灶依赖于Hsp42和Btn2。删除的单元格BTN2型（IG239-2B）或热休克蛋白42（IG238-9D）和表达Cmr1 YFP的细胞用MMS或MG132处理2 h.对每种条件下的100-200个细胞进行两到三次重复分析。误差线代表95%的置信区间。(d日)Cmr1定义INQ。表达Cmr1-YFP（IG66）、樱桃-VHL（pESC-mCherry-VHL）和Nup49-CFP（pNEB21）的细胞在25 °C至对数相，在缺乏色氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基中，以2%棉籽糖为碳源。通过添加3%半乳糖3诱导樱桃-VHL表达 h、 然后切换到37 °C和75°C处理 微克 毫升−1MG132在2%葡萄糖中1次 成像前h。箭头标记VHL和Cmr1焦点。使用Volocity软件（PerkinElmer）对图像进行反卷积。比例尺，2 微米。(e（电子）)中描述的病灶量化d日樱桃-VHL焦点(n个=214）位于核外围内外，与Cmr1-YFP共同定位。(如果)Cmr1和CCT-伴侣蛋白复合物共同定位于核周病灶。细胞表达Cmr1-yEmRFP（IG111）、Nup49-CFP（pNEB21）和Cct6-YFP（pIG20）。橙色箭头、Cmr1和Cct6共同定位于核周病灶。黄色箭头，Cct6焦点。比例尺，2 微米。(克)在DNA损伤响应期间，Cmr1没有退化。G1阳性细胞（IG174）被释放到含有200 微克 毫升−1环己酰亚胺（CHX）或0.05%MMS。60岁之后 MMS治疗、CHX和75分钟 微克 毫升−1添加MG132或CHX和MG132。使用免疫印迹法分析Cmr1-TAP和微管蛋白立方厘米1Δ（DP1）作为阴性对照。与添加CHX前采集的样品相关的Cmr1蛋白水平显示在印迹下方。
图4
图4。Cmr1与染色质和复制因子相互作用。
(一)双分子荧光互补（BiFC）分析原理示意图。将金星荧光蛋白的N端（VN）和C端（VC）非荧光片段与假定的相互作用蛋白融合，通过荧光信号的出现来评估其物理关联。(b条)BiFC中Cmr1相互作用伙伴的基因本体（GO）富集分析。图中显示的GO生物过程术语明显过多。条形图表示使用BinGO确定的属于所指示的GO项的Cmr1交互因子的百分比。P（P）-数值由Fisher计算t吨-使用Benjamini和Hochberg错误发现率校正进行测试和校正。(c（c）)MMS增强了Cmr1与Mcm3的交互。表达Cmr1-VC、Mcm3-VN和NLS-yEmRFP的BiFC筛选菌株在用0.05%MMS处理2周前后进行荧光显微镜检查 h.比例尺，2 微米。(d日)细胞中Cmr1-Mcm3相互作用信号强度的量化c（c）对每种情况下100-200个细胞的两到三个重复进行分析。方框图以任意单位（AU）显示核荧光强度，其中方框的横线表示样本中值，方框的末端为第25和75个百分位，晶须表示最小值和最大值。
图5
图5。Cmr1参与复制应激反应。
(一)Mrc1和Cmr1病灶在复制应激期间共存。在未经处理的细胞（IG160-4A）和经MMS处理的细胞中评估Cmr1-YFP和Mrc1-CFP之间的协同标度 h.显示代表性图像。比例尺，2 微米。箭头表示INQ焦点。(b条)针对HU、MMS和MG132对Mrc1和Cmr1共同定位的量化(n个>200). (c（c）)检查点缺陷型Mrc1AQ蛋白积聚在细胞核中。对Mrc1-YFP（IG147）和Mrc1AQ-YFP进行成像。比例尺，2 微米。(d日)Mrc1AQ蛋白水平的量化。来自的图像c（c）量化了(n个>150). 方框图以任意单位（AU）显示荧光强度，其中方框的横线表示样本中值，方框的末端为第25和75个百分位，晶须表示最小值和最大值。(e（电子）)检查点缺陷Mrc1AQ显示，INQ招聘人数减少。用0.05%MMS治疗2个月后，定量Mrc1-YFP或Mrc1AQ-YFP病灶细胞的百分比 h.误差条代表95%置信区间(n个>150). (如果)Mrc1焦点形成需要BTN2型和热休克蛋白42在野生型（IG147）中评估Mrc1-YFP定位，btn2Δ（CC1–3B）和hsp42Δ（CC2-6B）电池。显示了Mrc1定位的代表性图像。比例尺，2 微米。(克)中Mrc1病灶的量化热休克蛋白42Δ和btn2号机组Δ突变体如所示如果。误差条表示95%的置信区间。两个重复，n个>250. (小时)Mrc1融合到荧光计时器的示意图。计算sfGFP（快熟）和mCherry（慢熟）荧光强度之间的比值，作为Mrc1蛋白周转的度量。(我)Mrc1蛋白周转的量化。在野生型（CC98）和btn2Δ（CC102-9C）菌株。方框图显示如下d日.两个副本，n个>100. (j个)CMR1公司缺失抑制了检查点突变体的DNA损伤敏感性。将十倍系列稀释液涂敷在含有指定药物的YPD或YPD上。菌株为ML8–9A（wt）、DP1(cmr1Δ)，IG156-7D(mrc1Δ)，IG156-6C(mrc1Δcmr1Δ)，IG257-9C(pph3Δ)，IG257-2C(pph3Δcmr1Δ)，IG177-9C(ctf18Δ)和IG177-8C(ctf18Δcmr1Δ). (k个)cmr1Δ是由同源重组突变体合成的。将十倍系列稀释液涂敷在含有0.001%MMS的YPD或YPD上。菌株为ML8-9A（wt）、DP1(厘米1Δ)，图164-1D(mre11Δ)，IG164-2B(mre11Δcmr1Δ)，IG162-1D(rad52Δ)和IG162-2D(rad52Δcmr1Δ).
图6
图6。Cmr1促进适应DNA损伤检查点。
(一)Cmr1基因与检查点失活途径的相互作用在功能上与INQ相关。野生型（ML8–9A），cmr1Δ（DP1），直径2Δ（CC4–19D），直径2Δcmr1Δ（CC4-3B），pph3Δ（IG257-9C），cmr1Δpph3Δ（IG257-2C），直径2Δpph3Δ（IG296-2C），cmr1Δdia2Δpph3Δ（IG296-49B），hsp42Δpph3Δdia2Δ（IG322-12A）和btn2Δpph3Δdia2Δ（IG323-19D）菌株被电镀。(b条)INQ突变体存在检查点适应缺陷。带有条件的菌株cdc13-1型突变和其他野生型（ML815-8A），外显子1Δ（DLY1296），厘米1Δ（ML808-12D），转速3Δ（ML807-2D），btn2号机组Δ（ML821-4C）或热休克蛋白42检查Δ（ML822-4C）。(c（c）)INQ突变体在适应期间的Rad53去磷酸化中有缺陷。cdc13-1型突变体在25岁时生长 °C，然后切换到限制温度37 摄氏度。在0、6和24时采集样本 温度变化后h。通过免疫印迹和相对位移（Rad53）检测Rad53磷酸化P（P）/（Rad53+Rad53P（P）))在下面的面板中对每个样本进行了量化。误差条反映了两个独立实验的标准偏差。(d日)之间的负遗传相互作用cmr1Δ和slx8Δ.野生型（ML8–9A），cmr1Δ（DP1），slx8Δ（NEB290-1B）和cmr1Δslx8Δ（IG256-5D）菌株被电镀。(e（电子）)Cmr1和Slx8促进SUMO焦点的周转。野生型，cmr1Δ,slx8Δ和立方厘米1Δslx8Δ细胞（与d日)对体外表达的yEmRFP-Smt3（pML133）进行成像。对Smt3病灶细胞的百分比进行量化。误差条表示95%的置信区间(n个>100）。(如果)Sumoyated和polysumoyated蛋白质在cmr1Δ突变体。实验中的细胞d日用表达3myc-Smt3的质粒（pRS313-3myc-Smt3）进行转化，在对数期收获，并在全细胞提取物上使用抗myc-coupled dynabeads进行免疫沉淀。温度敏感型ubc9-137岁时生长的突变体（IG246-2C） °C用作阴性对照。使用ImageJ从两个独立的实验中量化了与高分子量（高MW）SUMO共轭物相对应的带。误差线表示s.d(克)在INQ对Slx8和SUMO进行联合定标。对表达Cmr1-CFP、Slx8-YFP和yEmRFP-Smt3（用pML133转化的IG302-1D）的细胞进行成像。图中显示了Smt3和Slx8在INQ（Cmr1）处共同定位的代表性图像。比例尺，2 微米。(小时)INQ含有琥珀酰化蛋白。在野生型（IG66）和ubc9号机组ts秒37℃孵育后的突变株（IG246-2C） 2°C 在0.05%MMS的存在下，h。误差条代表95%置信区间(n个>100).
图7
图7。hWDR76相互作用网络和亚核定位表明Cmr1功能保持不变。
(一)Cmr1和人员WDR76的域组织。人类WDR76与来自酿酒酵母。填充框表示WD40重复。NLS，假定的核定位信号。(b条)人类WDR76与HELLS、SUGT1、XRCC5、XRCC6和CCT–TRiC复合体相互作用。用GFP-WDR76或空载体转染SILAC标记的HeLa细胞。使用GFP-Trap树脂富集GFP-WDR76及其相互作用蛋白。蛋白质通过SDS-PAGE分解，并用胰蛋白酶在凝胶中消化。肽在四极轨道质谱仪上进行分析。该图显示了与GFP-WDR76相关的蛋白质与背景相比的对数（10）SILAC比率。WDR76以红色突出显示，还指示了其他几个交互器。(c（c）)人类WDR76定位于核病灶。GFP-WDR76转染后24小时，用10 μM MG132或1.5 mM MMS用于2 h.用抗53BP1抗体对53BP1进行免疫荧光分析。DAPI染色细胞核。比例尺，20 微米。(d日)人类WDR76不能与PCNA共存。用GFP-WDR76转染稳定表达的RFP-PCNA U2OS细胞。24 转染后h，细胞固定并用DAPI染色。比例尺，20 微米。(e（电子）)Cmr1在促进复制恢复中的角色模型。有关详细信息，请参阅讨论。
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