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.2015年4月;125(4):1433-45.
doi:10.1172/JCI79735。 Epub 2015年3月23日。

NRF2在神经退行性变和急性神经损伤中促进神经元存活

NRF2在神经退行性变和急性神经损伤中促进神经元存活

熊文军(Wenjun Xiong)等。 临床研究杂志. 2015年4月.

摘要

氧化应激在许多疾病条件下以及在正常衰老过程中导致神经元丢失;然而,减少氧化的小分子药物在预防神经退行性变方面并没有取得成功。此外,即使可以有效地系统性减少活性氧和/或氮物种(ROS/NOS),也可能产生有害的副作用,因为这些分子调节正常的生理过程。一种更有效和更有针对性的方法可能是仅在遭受氧化的细胞中增强内源性抗氧化防御机制。在这里,我们创建了几个腺相关病毒(AAV)载体来传递抵抗氧化的基因。这些载体编码转录因子NRF2和/或PGC1a,这些转录因子调节数百个抵抗氧化和其他形式的压力的基因,或超氧化物歧化酶2(SOD2)和过氧化氢酶等酶,这些酶直接解毒ROS。我们在3个光感受器退化模型和一个神经挤压模型中测试了这种方法的有效性。AAV介导的NRF2传递比SOD2和过氧化氢酶更有效,而PGC1a的表达加速了光感受器的死亡。由于NRF2介导的神经保护作用延伸至光感受器和视网膜神经节细胞,这两种类型的神经元非常不同,这些结果表明,这种靶向方法可能广泛适用于许多细胞遭受氧化损伤的疾病。

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图8
图8。ONC后2周和4周RGC存活率。
(A类C类)视网膜扁平支架中RGC细胞的免疫染色。ONC前两周,成年C57Bl/6J小鼠的眼睛接受玻璃体内注射表达GFP的AAV2载体(n个= 4) (A类),SOD2-2A-CAT(n个= 6) (B类),或NRF2(n个= 6) (C类). ONC后2周采集视网膜,并对β3-微管蛋白(Tuj1)(绿色)进行染色,这是一种特殊的RGC标记物。(D类)ONC后2周和4周RGC存活率的量化。数量标准化为WT C57Bl/6J视网膜,无ONC。每组检查的视网膜数量显示在每个条形图中。误差条代表平均值±SEM*P(P)<0.05和**P(P)通过双向方差分析得出<0.01。
图7
图7。AAV-NRF2感染后的功能评估。
(A类)视光检查用于测试第10行未注射或单独注射AAV-GFP或AAV-GFP+AAV-NRF2的小鼠。左眼和右眼分别显示。(B类)年左右眼视力比第10行P40和P50小鼠。(C类D类)在第10行第40页的小鼠。典型波形(C类)b波振幅的平均R/L眼比(D类)用于控制(n个=17)和AAV-NRF2–处理(n个=23)显示小鼠。每组测试的小鼠数量显示在每个栏中。误差条代表平均值±SEM*P(P)<0.05和***P(P)<0.0001由未配对的双尾学生t吨测试。
图6
图6。AAV-NRF2处理视网膜的氧化评估。
(A类F类)氢乙硫胺与P40外周横截面上的超氧物反应后发出红色荧光第10行视网膜感染AAV-GFP(A类C类)和AAV-GFP加AAV-NRF2(D类F类). (G公司L(左))P30抗丙烯醛染色第1版视网膜感染AAV-GFP(G公司,H(H),以及K(K))以及AAV-GFP和AAV-NRF2(,J型,以及L(左)). (K(K)L(左))视网膜中背侧区域的高放大图像(以红色边框突出显示)如所示H(H)J型.比例尺:20μm(A类F类,K(K),以及L(左)); 1.5毫米(G公司J型).
图5
图5。NRF2对锥体形态的影响。
(A类B类)P50中存活锥体的PNA染色(红色)第1版视网膜。所有图像均取自视网膜背中部区域(距视神经头背侧约1.5 mm)。插图是单个细胞的高倍图像(原始放大倍数,×40A类,B类,D类,以及E类插图)。(C类)GFP百分比的量化+P50中背区锥体PNA染色第1版视网膜。每组的每个视网膜大约有300个细胞。误差条代表平均值±SEM。量化的视网膜数量显示在每个条中*P(P)<0.05(未配对双尾学生)t吨测试。(D类E类)P30的PNA染色第1版视网膜。(F类)WT视网膜中的PNA(红色)和S+M视蛋白(白色)染色。定位于锥体OS的Opsin蛋白。(G公司L(左))P160中的PNA和视蛋白染色–/–视网膜。在AAV-GFP感染的视网膜中观察到缺乏PNA染色和视蛋白在细胞体上的错误定位(n个= 9) (G公司)而PNA和视蛋白共同定位于感染AAV-GFP和AAV-NRF2的视网膜中剩余的锥膜结构(n个= 6) (J型L(左)). 比例尺:20μm。
图4
图4。抗氧化TFs对球果存活的影响。
(A类)AAV-PGC1a和AAV-NRF2构造的示意图。(B类D类)平板安装P50第1版表达GFP、NRF2和PGC1a的AAV载体感染视网膜(n个= 10) (B类)、GFP和NRF2(n个= 8) (C类)、GFP和PGC1a(n个= 15) (D类). (E类G公司)视网膜背中部的持续锥体。(H(H))在第1版感染指定结构后的退化。补充表1总结了每组检查的视网膜平均锥体密度和数量。误差条代表平均值±SEM*P(P)< 0.05, **P(P)<0.01,以及***P(P)通过双向方差分析,<0.0001。(J型)平板安装P110第10行表达GFP的AAV载体感染视网膜(n个= 6) ()以及GFP和NRF2(n个= 13) (J型). (K(K)L(左))中背视网膜的高倍图像。(M(M)P(P))平板安装P160–/–表达GFP的AAV载体感染视网膜(n个= 9) (M(M))以及GFP和NRF2(n个=6)(N个),具有高倍图像(O(运行)P(P)). ()P110中锥体密度的量化第10行和P160中–/–视网膜。每组视网膜数量的量化显示在每个条形图的底部。误差条代表平均值±SEM**P(P)<0.01(未配对双尾学生)t吨测试。比例尺:1.5 mm(B类D类,,J型,M(M),以及N个); 50微米(E类G公司,K(K),L(左),O(运行),以及P(P)).
图3
图3。SOD2和过氧化氢酶对球果存活的影响。
(A类)AAV-GFP和AAV-SOD2-2A-CAT结构示意图。(B类)IHC显示AAV载体在平板P60中的异位SOD2和过氧化氢酶表达第1版视网膜。(J型L(左))平板安装P50第1版表达GFP的AAV载体感染视网膜(n个= 29) (J型)以及GFP、SOD2和过氧化氢酶(n个= 7) (L(左)). D、 背侧;N、 鼻;五、 腹侧;T、 暂时的。(K(K)M(M))每组均显示了视网膜背中部(视神经头背侧1.5mm)250μm×250μm正方形内的持续锥体的高放大图像。(N个)锥体密度量化方案说明。选择位于视神经头背侧、鼻侧、腹侧和颞侧1.5mm处的一个250μm×250μm正方形来表示扁平视网膜每一小叶的锥体存活。GFP公司+计算每个正方形中的锥体,每个视网膜使用4个正方形的平均数。(O(运行))施工期间的锥体密度第1版退化。每组平均每个时间点有17个视网膜被量化。误差条代表平均值±SEM**P(P)<0.01由未配对的双尾学生t吨测试。比例尺:20μm(B类); 1.5毫米(J型L(左)); 50微米(K(K)M(M)).
图2
图2。锥状细胞表达来自带有CMV启动子的AAV8的高水平GFP。
(A类)在P0感染和P30成像后,对切除的视网膜进行AAV-GFP驱动的GFP荧光(绿色)成像。(B类)AAV-GFP感染视网膜的交叉切片。ONL显示高度感染(绿色)。(C类)视网膜横截面的高分辨率图像显示几乎所有视锥细胞中都有明亮的GFP(与红色的PNA标记),而一些视杆细胞中GFP的表达较弱。(D类F类)5个月大婴儿的短波和中波视蛋白染色(S+M视蛋白,以白色显示)–/–AAV-GFP感染小鼠视网膜。Opsin染色与GFP在锥体中的表达一致。比例尺:0.5 mm(A类B类); 20微米(C类F类).
图1
图1。内源性抗氧化酶在小鼠光感受器中的表达。
(A类)本研究中使用的3个RP小鼠模型的杆和锥死亡动力学示意图。(B类E类)内源性SOD2的免疫染色(B类C类)和GPX1(D类E类)WT视网膜横截面中的蛋白质。圆锥OS和IS以PNA(绿色)突出显示。这两种酶在光感受器IS中富集。箭头指向圆锥体,圆锥体表达的SOD2/GPX1水平高于周围的棒。(F类)SOD2标准(F类G公司)和GPX1(H(H))P30中的表达第1版视网膜。OS、IS和ONL已塌陷成薄层,SOD2/GPX1表达大部分丢失。比例尺:5μm(B类).

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