Cadherin-6B undergoes macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis during cranial neural crest cell EMT

doi:10.1242/jcs.164426

.2015年5月1日；128(9):1773-86.

doi:10.1242/jcs.164426。 Epub 2015年3月20日。

钙粘蛋白-6B在颅神经嵴细胞EMT期间经历大胞饮作用和网格蛋白介导的内吞作用

兰加拉扬·帕德马纳班¹, 丽莎·塔尼希尔²

附属公司

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所，邮编：20892。
²美国马里兰州帕克学院马里兰大学动物和鸟类科学系，邮编：20742ltaney@umd.edu。

PMID： 25795298
预防性维修识别码：项目经理446736
内政部： 10.1242/jcs.164426

钙粘蛋白-6B在颅神经嵴细胞EMT期间经历大胞饮作用和网格蛋白介导的内吞作用

兰加拉扬·帕德马纳班等。细胞科学杂志. 2015.

.2015年5月1日；128(9):1773-86.

doi:10.1242/jcs.164426。 Epub 2015年3月20日。

作者

兰加拉扬·帕德马纳班¹, 丽莎·塔尼希尔²

附属公司

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所，邮编：20892。
²美国马里兰州大学动物与鸟类科学系，马里兰州大学帕克，邮编：20742ltaney@umd.edu。

PMID： 25795298
预防性维修识别码：项目经理446736
内政部： 10.1242/jcs.164426

摘要

上皮-间充质转化（EMT）对于发育过程中迁移神经嵴细胞的形成非常重要，并与癌症转移等人类疾病相关。雏鸡繁殖前颅骨神经嵴细胞失去细胞间接触，部分由Cadherin-6B（Cad6B）介导，广泛迁移，随后形成多种成人衍生物。重要的是，Cad6B的调节对于正确的神经嵴细胞EMT至关重要。虽然Cad6B具有较长的半衰期，但它很快从消化前神经嵴细胞膜上消失，这表明在EMT期间存在翻译后机制。我们在Cad6B细胞质尾部发现了一个基序，该基序增强了Cad6B的内化作用，并降低了Cad5B突变后的稳定性。此外，我们首次证明，Cad6B通过细胞表面内化事件（包括网格蛋白介导的内吞作用和大胞饮作用）从消化前神经嵴细胞中去除。这两个过程都依赖于动力蛋白的功能，抑制Cad6B内化会消除神经嵴细胞EMT和迁移。总之，我们的发现揭示了翻译后事件在神经嵴细胞EMT和迁移期间控制钙粘蛋白的重要性。

关键词：钙粘蛋白；EMT；细胞内吞；大胞饮症；神经嵴。

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数字

**图1。**
**Cad6B定位于细胞质。**固定（A–A〃）FlpIn-wtCad6B细胞，并对Cad6B（绿色）和Na进行免疫染色⁺K（K）⁺ATP酶（红色）。面板表示多个Z轴-用共焦获得的叠加图像。Cad6B与几个含Na的细胞质斑点共定位⁺K（K）⁺ATP酶（A〃，箭头）。（B–B〃）对具有启动EMT的神经嵴细胞的胚胎进行固定，并对Cad6B（绿色）和Na进行免疫染色⁺K（K）⁺ATP酶（红色）。Cad6B与Na共定位⁺K（K）⁺ATP酶阳性点（B〃，箭头），膜Cad6B用箭头表示。（C，C′）移植具有前消化神经嵴细胞的背神经皱襞，进行EMT，固定并对Cad6B进行免疫染色。C′是C.盒状区域的高倍视图。Cad6B定位于细胞质（C′，箭头）。比例尺：10 微米。

**图2。**
**Cad6B斑点本质上是内吞性的，而不是外吞性的。**将识别Cad6B胞外结构域（NT-6B）的（A–A〃）Cad6B抗体导入用膜相关GFP电穿孔的胚胎内腔，培养以允许EMT，用NT-6B抗体（红色）和GFP（绿色）固定并免疫染色。（B–B〃）A中盒状区域的高倍图像。在分层的神经嵴细胞中，GFP表达的质膜（B〃，箭头）范围内的细胞质中可以看到内部化的NT-6B抗体–Cad6B复合物。将NT-6B抗体添加到FlpIn-wtCad6B细胞（C–C〃）和背侧神经折叠外植体（D–D〃）的培养基中，然后培养以允许EMT、低pH缓冲液洗涤、固定NT-6B（C，D）和HA（C′）或CT-6B（D′）的免疫染色。内部化的NT-6B抗体–Cad6B复合物定位于细胞质（C〃，D〃，箭头），Cad6B仍在质膜上观察到（C〃.，D〃.，箭头）。除C–C〃之外的所有图像都表示几个Z轴-用共焦获得的叠加图像。C–D〃中的插入框显示原始图像，C和D中的星号表示主面板中高倍视野的位置。比例尺：10 微米。

**图3。**
**Cad6B在其细胞质域中具有推测的内吞基序。**（A） Cad6B近膜结构域与几种II型钙粘蛋白的一部分排列。双亮氨酸和假定的p120-catenin结合基序突出显示（黄色）。EC，胞外结构域；T、跨膜结构域；JMD，juxtamembrane域。固定表达wtCad6B（B–B〃）、LI645AA（C–C〃）和EED666AAA（D–D〃）的FlpIn细胞，并对Cad6B（绿色）和p120-catenin（紫色）进行免疫染色。面板表示单个共焦平面图像。箭头指向膜结合的Cad6B和p120-catenin，插入符号表示Cad6B-阳性，p120-catanin阴性的细胞质点。B–D〃中的插入框显示原始图像，B、C、D中的星号表示主面板中放大倍数较高的区域的位置。比例尺：10 微米。

**图4。**
**Cad6B具有功能性内吞基序。**（A）对来自FlpIn-wtCad6B、-LI645AA和-EED666AAA细胞的可溶性（溶胶）和不溶性（不溶性）组分进行SDS-PAGE。（B）不溶性：可溶性Cad6B的密度比来自三份印迹。（C）表达Cad6B构建物的FlpIn细胞进行表面生物素化并在37°C下培养，然后使用链霉亲和素琼脂糖和SDS-PAGE进行生物素免疫沉淀（IP）。（D）内化生物素化部分的量化（内化生物素化蛋白质/总表面生物素化蛋白质）。（E）表达Cad6B构建物的FlpIn细胞经环己酰亚胺（CHX）处理、裂解并进行SDS-PAGE。从LI645AA免疫印迹中剔除时间0和其他两个时间点之间不相关的车道。（F） E.密度比（Cad6B:actin）的量化数据显示平均值±标准偏差**P（P）*<0.05（B，D）**P（P）*<0.001（F）。

**图5。**
Cad6B不与小窝蛋白-1共定位，但部分与网格蛋白共定位*在体外*固定（A–A〃）FlpInwtCad6B细胞，并对Cad6B（绿色）和caveolin-1（红色）进行免疫染色。插入符号表示没有Cad6B和caveolin-1共定位。固定表达wtCad6B（B–B〃）、LI645AA（C–C〃）和EED666AAA（D–D〃）的FlpIn细胞，并对Cad6B（绿色）和氯氰菊酯（红色）进行免疫染色。面板表示单个共焦平面图像。B〃、C〃、D〃中的箭头显示Cad6B和氯氰菊酯共定位，插入符号指向未与氯氰菊酯共定位的Cad6B-puncta。插入框显示原始图像，星号表示主面板中高倍视野的位置。比例尺：10 微米。

**图6。**
**Cad6B与氯菊酯部分共定位体内.**（A–A〃）对神经嵴细胞积极接受EMT的胚胎进行固定，并对Cad6B（绿色）和氯氰菊酯（红色）进行免疫染色。（B–B〃）A中方框区域的高倍视图。面板表示几个Z轴-将用共焦显微镜获取的图像叠加。B〃中的箭头表示Cad6B和氯氰菊酯共定位，插入符号表示Cad6-B阳性，氯氰菊酯阴性。比例尺：10 微米。

**图7。**
**Cad6B与p120-catenin在细胞溶质点部分共定位体内.**（A–A〃）对神经嵴细胞积极接受EMT的胚胎进行固定，并对Cad6B（绿色）和p120-catenin（红色）进行免疫染色。（B–B〃）A中方框区域的放大倍数更高的视图。面板代表几个Z轴-用共焦获得的叠加图像。B〃中的箭头指向胞浆中的共定位Cad6B和p120-catenin，箭头显示膜上的共定位镉6B和p120-catenin，插入符号显示Cad6B-阳性，p120-catanin-阴性点。比例尺：10 微米。

**图8。**
**Cad6B经历动力依赖性大胞饮作用。**向外植体培养基中添加载体（DMSO，A–A〃）、dynasoir（B–B〃），latrunculin A（C–C〃）或EIPA（D–D〃）。培养外植体以进行EMT，固定并免疫染色Cad6B（绿色）和p120-catenin（红色；A′，A〃，B′，B〃，D′，D〃）或用阴茎肽染色（红色；C′，C〃）。A〃中的箭头和箭头分别代表Cad6B和p120-catenin在细胞膜和细胞质中的共同染色。B〃、D〃箭头显示Cad6B和p120-catenin双阳性胞质斑点。C〃中的箭头表示膜相关Cad6B。A〃、B〃、D〃中的插入符号指向Cad6B阳性，p120-catenin-negative点。面板代表几个面板的三维组合Z轴-用共焦获得的叠加图像。插图显示原始图像，A–D中的星号表示主面板中放大倍数较高的字段的位置。比例尺：10 微米。

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[7] Bonifacino JS，Traub LM公司。跨膜蛋白到内体和溶酶体的分选信号。每年。生物化学评论。2003;72:395–447. doi:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161800。-DOI程序-公共医学

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