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.2015年3月11日；5(5):857-72.
doi:10.1534/g3.115.016667。

多种磷酸酶调节巢状曲霉碳源依赖性萌发和初级代谢

莱安德罗·何塞·德·阿西斯 1, 劳雷·尼古拉·安妮克·里斯 1, 马塞拉·萨沃迪 1, 泰萨·马格纳尼·迪纳马尔科 2, 古斯塔沃·恩里克·戈德曼 三, 尼尔·安德鲁·布朗 4
附属公司

多种磷酸酶调节巢状曲霉碳源依赖性萌发和初级代谢

莱安德罗·何塞·德·阿西斯等。 G3（贝塞斯达）. .

摘要

巢状曲霉是真菌细胞生物学研究的重要霉菌和模型系统。此外，侵袭性念珠菌肺部感染在慢性肉芽肿性疾病患者中很常见。从休眠分生孢子到活性生长丝状菌丝的形态和生化转变需要许多生物合成、发育和代谢过程的协调。本研究显示了七种磷酸酶在调节细胞周期、发育和代谢以响应葡萄糖和替代碳源方面所起的作用的多样性。已鉴定的磷酸酶强调了调节丝状体生长的几个信号通路的重要性，丙酮酸脱氢酶复合体作为控制碳使用的代谢开关的作用，以及确定了α-酮戊二酸脱氢酶在发芽过程中发挥的关键作用。这些对众多磷酸酶在发芽和碳传感中的基本作用的新见解为鉴定真菌发芽抑制剂提供了新的研究途径，对食品、饲料和制药行业都有意义。

关键词：细胞周期；发芽；糖代谢；磷酸酶。

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数字

图1
图1
初级碳代谢A.鸟巢以及参与糖酵解、甘油代谢、发酵、TCA循环（用红色表示）和糖异生（用蓝色表示）每个生化步骤的代表性基因。G6P=葡萄糖6磷酸盐；F6P=果糖6磷酸盐；F1,6BP=1,6二磷酸果糖；GA3P=3磷酸甘油醛；DHAP=磷酸二羟丙酮；G3P=磷酸甘油；1,3diPG=1,3二磷酸甘油酯；3PG=3磷酸甘油酸；2PG=2磷酸甘油酸；PEP=磷酸烯醇式丙酮酸盐；DH=脱氢酶。
图2
图2
七个NPP无效突变体和野生型菌株（FGSC A4）在各种碳源存在下的生长。真菌菌株直接在补充有1%各自碳源的最小培养基琼脂平板上生长，但最后一个柱除外，其中分生孢子在接种葡萄糖之前在CA中预培养4小时。所有培养物在37°下培养48小时。CA水解酪蛋白；CA+Glu，水解酪蛋白+葡萄糖；以及在水解酪蛋白中预生长并转移到葡萄糖中的Pre-CA到Gluc。
图3
图3
葡萄糖和CA萌发过程中的分生孢子海藻糖水平77个NPP缺失突变体和野生型菌株的分生孢子在最小培养基上加上葡萄糖或CA，作为唯一碳源，在37°下萌发150分钟。用分生孢子的总蛋白裂解物测定海藻糖，并与标准曲线进行比较。C=对照（水中新鲜分生孢子）；Glu=葡萄糖；CA=水解酪蛋白。给出了三个独立实验的平均值（±标准偏差）。重要性=*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001. 条形图上方的线条显示了野生型和突变对照之间的比较，或者每个特定菌株的对照和Glu/CA处理之间的比较。
图4
图4
七个NPP突变体和野生型菌株的葡萄糖和氧气消耗。将分生孢子接种在添加CA的最小培养基中24小时，然后将菌丝转移到最小培养基和葡萄糖中24小时耗氧速率[ng原子O/min/干重（mg）]。介绍了NPP突变体中葡萄糖和氧气消耗的百分比。结果是三个独立实验的平均值（±平方偏差）。重要性=*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.
图5
图5
三个NPP突变体和野生型菌株（FGSG A4）中三个主要葡萄糖转运蛋白编码基因的表达。菌丝体在最小培养基加CA中培养24小时，然后转移到最小培养基+葡萄糖中培养2或4小时。（A）AN1797的基因表达(hxtB（赫兹）)，（B）AN10891(hxtC（赫兹）)和（C）AN6669(hxtE（赫兹）)通过RT-qPCR测量，并将值标准化为tubC的表达。这些值是三个独立实验的平均值（±标准偏差）。在所有NPP突变体中，葡萄糖转运蛋白编码基因表达显著降低(P（P）< 0.05).
图6
图6
在以葡萄糖作为唯一碳源的条件下生长期间，NPP突变体和野生型菌株菌丝体中的细胞内丙酮酸（A）、甘油（B）和海藻糖（C）水平。分生孢子在最小培养基和CA中培养24小时。随后，将菌丝转移到最小培养基加1%葡萄糖中培养24 h。平均浓度由三个独立实验测定（±标准偏差）。甘油、海藻糖和丙酮酸的浓度以μmol.mg表示−1.重要性=*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.
图7
图7
七个NPP无效突变体和野生型菌株（FGSC A4）在特定点进入TCA循环的氨基酸组合（每个氨基酸50 mM）上生长：丙酮酸（丙氨酸和甘氨酸）、乙酰辅酶a（亮氨酸和赖氨酸）、酮戊二酸（精氨酸、脯氨酸、组氨酸和谷氨酰胺），琥珀酰辅酶A（异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和苏氨酸）、富马酸（酪氨酸和苯丙氨酸）和草酰乙酸（天冬酰胺和天冬氨酸）。所有菌株在37°下培养96小时。
图8
图8
ADP/ATP比率。将7个NPP缺失突变体在最小培养基加CA上培养24小时，然后转移到最小培养基再加葡萄糖上培养24 h。使用ADP/ATP比率测定试剂盒（Sigma），使用菌丝的总蛋白裂解物（10μg）量化ADP/ATP比。重要性=*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.
图9
图9
七个NPP缺失突变体和野生型菌株（TN02A3）中的α-酮戊二酸脱氢酶活性。分生孢子在最小培养基加CA中萌发24小时，然后转移到最小培养基+葡萄糖中再培养24小时。显示的α-酮戊二酸脱氢酶平均活性代表三个独立的实验（±平方偏差）。重要性=*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.
图10
图10
基因转录谱分析ΔptpB和野生型（TN02A3）菌株从CA转移到葡萄糖作为唯一碳源4小时后。（a和B）转移到葡萄糖后差异上调和下调基因的文氏分析(P（P）<0.01）确定了菌株特异性转录调控。（C） MIPS功能分类揭示了菌株特异性转录调控的功能概况。
图11
图11
热图显示了编码参与糖酵解、糖异生、发酵和TCA循环的蛋白质的选定基因在野生型和ΔptpB菌株。
图12
图12
野生型初级碳代谢相关代谢酶编码基因的RT-qPCR分析，ΔptpB,Δ消息A,ΔptcD、和ΔptcE菌株从CA转移到葡萄糖作为唯一碳源。（A） 安3223(功率因数千安)，（B）AN8979(加拿大铝业公司)，（C）AN1726(个人数字助理)和（D）AN8793(汽车C).
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