Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants

doi:10.1093/hmg/ddv081

.2015年6月1日；24(11):3272-85.

doi:10.1093/hmg/ddv081。 Epub 2015年3月5日。

口罩功能丧失挽救果蝇pink1和parkin突变体的线粒体损伤和肌肉退化

朱明伟¹, 夏丽¹, 田晓林², 吴春来²

附属公司

¹美国路易斯安那州立大学健康科学中心细胞生物学和解剖学系神经科学卓越中心，新奥尔良，LA 70112。
²美国路易斯安那州立大学健康科学中心细胞生物学和解剖学系神经科学卓越中心，新奥尔良，LA 70112xtian@lsuhsc.edu cwu@lsuhsc.edu。

PMID： 25743185
预防性维修识别码：项目经理4424960
内政部： 10.1093/毫克/日v081

口罩功能丧失挽救果蝇pink1和parkin突变体的线粒体损伤和肌肉退化

朱明伟等。人类分子遗传学. 2015.

.2015年6月1日；24(11):3272-85.

doi:10.1093/hmg/ddv081。 Epub 2015年3月5日。

作者

朱明伟¹, 夏丽¹, 田晓林², 吴春来²

附属公司

¹美国路易斯安那州立大学健康科学中心细胞生物学和解剖学系神经科学卓越中心，新奥尔良，LA 70112。
²美国路易斯安那州立大学健康科学中心细胞生物学和解剖学系神经科学卓越中心，新奥尔良，LA 70112xtian@lsuhsc.edu cwu@lsuhsc.edu。

PMID： 25743185
预防性维修识别码：项目经理4424960
内政部： 10.1093/hmg/ddv081

摘要

PTEN诱导的激酶1（Pink1）和泛素E3连接酶Parkin以线性途径发挥作用，通过调节线粒体清除和转运来维持线粒体健康。这两种酶的突变会导致人类家族性帕金森氏病（PD），以及苍蝇体内缺陷线粒体的积累和细胞退化。在此，我们表明，人类中支架蛋白Mask（也称为ANKHD1（Ankyrin repeats and KH domain containing protein 1）的功能丧失以细胞自主的方式挽救了pink1或parkin突变引起的行为、解剖和细胞缺陷。此外，如果在线粒体营养不良已经表现出来的情况下，在帕金成虫中诱导面罩击倒，也可以实现类似的拯救。我们发现，Mask与Parkin在基因上相互作用，调节线粒体形态，并负向调节Parkin向线粒体的补充。我们还提供证据表明，Mask活性的丧失促进了自噬体标记物与线粒体在发育中的共定位，并且需要一条完整的自噬途径来通过掩盖功能丧失来修复parkin突变缺陷。总之，我们的数据强烈表明，Mask/ANKHD1活性可以通过组织和时间控制的方式被抑制，以在与PD-相关的病理条件下恢复线粒体完整性。

牛津大学出版社2015年出版。本作品由（a）美国政府雇员撰写，在美国属于公共领域。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
的功能丧失面具抑制两者的解剖和行为缺陷*粉红色1*和*停车场*变种苍蝇。(A类)野生型幼虫肌肉内源性Mask蛋白水平的Western blot分析，面具空(*面具^10.22/Df*)，杂合子(面具^10.22/+)和亚形态的(面具^P/10.22号)突变体。(B类)内源性Mask蛋白水平的量化标准化为相应的β-管蛋白水平，以野生型水平的百分比表示。(C类)胸廓塌陷表型（白色箭头）*粉红色1*和*停车场*突变体被面具部分功能丧失。(D类)胸廓塌陷表型的百分比。(E类)顶板：胸膛的纵向截面。中下部面板：3日龄苍蝇间接飞行肌肉的TEM分析。显示了比例尺。(F类)野生型总ATP水平的量化，*停车场*,*停车场*/面具或面具突变体。通过ATP测定获得的相对ATP水平被归一化为野生型，并表示为野生型成年人相对ATP水平的百分比。(**G公司**)飞行能力的量化。^#*P（P）*= 0.07, **P（P）*< 0.001, ***P（P）*< 0.005, ****P（P）*< 0.05.

**图2。**
肌肉中Mask的细胞自主击倒和多巴胺能神经元抑制*粉红色1*/*停车场*突变线粒体缺陷。(A类)表达对照RNAi（TRiP.JF01147）和面具RNAi（TRiP.HMS01045）。(B类)内源性Mask蛋白水平的量化标准化为相应的β-管蛋白水平。(C类)表达Mito-GFP和对照RNAi的野生型幼虫肌肉的典型单层共焦图像；*停车场*或*粉红色1*表达Mito-GFP的突变幼虫肌肉和对照或面具RNA干扰。每个插图都显示了装箱区域的高倍图像。比例尺，白色10µm；橙色3µm。(D类)野生型或野生型表达Mito-GFP的DA神经元簇的典型共焦图像*停车场*突变体成人大脑共同表达对照或面具RNAi。比例尺，5µm。(E类)表达GeneSwitch（GS）-MHC-Gal4、Mito-GFP和对照RNAi的野生型苍蝇*停车场*表达GS-MHC-Gal4、Mito-GFP和对照RNAi或面具羽化后立即收集RNAi，并在含有RU486的苍蝇食物中饲养。五天后，通过具有代表性的单层共焦图像显示的Phalloidin染色和Mito-GFP自荧光分析他们的间接搏动肌肉。比例尺，10µm。(F类)量化相对于肌肉面积的线粒体-GFP聚集面积。(**G公司**)5日龄婴儿飞行能力的量化*停车场*表达GS-MHC-Gal4、Mito-GFP和对照或面具RNAi。(**H（H）**)的寿命*停车场*表达GS-MHC-Gal4、Mito-GFP和对照或面具RNAi。（G和H的注释：羽化前，动物用不含RU486的食物饲养；羽化后，动物用含RU487的食物饲养）**P（P）*< 0.001.

**图3。**
在成年后期击倒面罩可以缓解*停车场*线粒体形态和功能的突变缺陷。(A类)五天大*停车场*表达GS-MHC-Gal4、Mito-GFP和面具RNAi（在不含RU486的食物中培养）显示出明显的线粒体形态缺陷。这些苍蝇被分为两组：一组在含有RU486的食物中饲养，另一组不含RU486。五天后，在*停车场*RU486治疗组突变体被显著抑制，而对照组没有。右侧面板显示左侧面板中装箱区域的高倍图像。比例尺，白色10µm；橙色5µm。(B类)量化相对于肌肉面积的线粒体GFP肿胀面积。(C类)飞行能力的量化**P（P）*< 0.001, ***P（P）*< 0.05,^#*P（P）*> 0.5.

**图4。**
损失面具功能改变线粒体的形态和分布。(**A–C**“）滑动野生型（A–A”）体壁肌肉的Z堆栈共焦图像视图，面具空（B–B〃），面具UAS-Mask转基因（C–C〃）幼虫肌肉表达为零。幼虫与磷脂（肌动蛋白）、抗ATP5α（线粒体）和抗Mask抗体共同染色，显示出单通道和合并通道。显示了俯视图（中央面板）和侧视图（底部和右侧面板）。比例尺，10µm。箭头标记内腔侧，星号标记幼虫体壁肌肉的表皮侧。侧位图像中的括号表示肌肉肌动蛋白丝层。注意，这一层的线粒体大量错位，仅在面具变异肌肉。(D类)幼虫肌肉内源性和转基因UAS-Mask蛋白表达水平的Western blot分析。(E类)野生型肌线粒体（Mito-GFP）的典型共焦图像，*博士1^1/2*，24B-Gal4驱动面具RNAi和*图纸1^1/2*加24B-Gal4驱动面具RNAi。

**图5。**
面罩对抗Parkin调节线粒体形态的功能。(A类)野生型幼虫表达24B-Gal4-driven UAS-mCherry-Parkin、Mito-GFP以及对照RNAi、面具RNAi或UAS-Mask，与抗GFP和抗DsRed抗体共同染色。每个插图都显示了装箱区域的高倍图像。比例尺，白色10µm；橙色3µm。(B类)mCherry-ATG8和Mito-GFP puncta共同定位平均面积的量化，以总肌肉面积的百分比表示（更多详细信息，请参见方法）***P（P）*< 0.05.

**图6。**
口罩作为选择性的有丝分裂抑制剂发挥作用。(A类)表达24B-Gal4-driven UAS-mCherry-ATG8、Mito-GFP和对照RNAi或面具RNAi，与抗GFP和抗DsRed抗体共同染色。插图显示了装箱区域的高倍图像。比例尺，白色5µm；橙色2µm。(B类)量化显示mCherry-ATG8和Mito-GFP共同定位的平均点刺数，并将其归一化为肌肉面积（有关更多详细信息，请参阅材料和方法）。(C类)胸部塌陷的苍蝇百分比*停车场*,*停车场*加*第18页^{KG03090公司/+}*,*停车场*加*面具^10.220/+*和*停车场*加*面具^10.220/+*加*第18天^{KG03090公司/+}*. (D类)表达24B-Gal4-driven UAS-mCherry-ATG8和对照RNAi的幼虫肌肉中mCherry-ATG8的Western blot分析面具RNAi或UAS掩膜，在产卵后93小时。箭头指向自由的mCherry。(E类)定量全长mCherry-ATG8和游离mCherry水平，作为自噬通量的读数。蛋白质水平的强度标准化为β-管蛋白，并显示为相对于对照组**P（P）*< 0.001. 不另作说明，不重要。

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1. Narendra D.P.、Youle R.J.（2011）《针对线粒体功能障碍：PINK1和Parkin在线粒体质量控制中的作用》。抗氧化剂。氧化还原。信号。，14, 1929–1938.-项目管理咨询公司-公共医学

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[9] Narendra D.P.、Youle R.J.（2011）《针对线粒体功能障碍：PINK1和Parkin在线粒体质量控制中的作用》。抗氧化剂。氧化还原。信号。，14, 1929–1938.-项目管理咨询公司-公共医学

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