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.2015年4月10日；427(7):1644-54.
doi:10.1016/j.jmb.2015.02.010。 Epub 2015年2月15日。

赖氨酸脱乙酰酶调节热休克反应，包括HSF1的年龄相关损伤

埃琳娜·泽林 1, 布莱恩·弗里曼 2
附属公司

赖氨酸脱乙酰酶调节热休克反应，包括与年龄相关的HSF1损伤

埃琳娜·泽林等。 分子生物学杂志. .

摘要

热休克因子1（HSF1）对保护细胞免受急性和慢性应激至关重要。在衰老细胞中，HSF1的DNA结合活性恶化，与神经退行性变和心脏病等病理事件的发生相关。我们发现HSF1与DNA的结合受赖氨酸脱乙酰酶控制，HDAC7、HDAC9和SIRT1显著增加了热休克反应（HSR）的大小和长度。相反，HDAC1以非乙酰化酶依赖的方式抑制HSF1。在老化细胞中，HDAC1水平升高，HSR受损，但老化细胞中HDAC1的减少可恢复HSR。我们的结果为HSR的年龄相关调节提供了一个机制基础。除HSF1外，脱乙酰酶还对无关DNA结合蛋白的活性进行差异调节。总之，我们的数据进一步支持赖氨酸脱乙酰酶是DNA结合蛋白的选择性调节器的模型。

关键词：老化；热冲击因子1；热冲击响应；赖氨酸脱乙酰酶。

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数字

图1
图1
赖氨酸脱乙酰酶选择性地解除GCN5对HSF1 DNA结合活性的抑制。(一)用标记的人类GCN5、SIRT1或HDAC1表达载体瞬时转染人类293T胚胎肾细胞。细胞在37°C（-）或42°C（+）下培养20分钟，EMSA使用放射性标记的HSE寡核苷酸显示HSF1 DNA结合活性。(b条)用GCN5和指示的赖氨酸脱乙酰酶表达载体瞬时转染293T细胞。细胞未经处理（-）或暴露在42°C下20分钟（+），HSF1 DNA结合由EMSA监测。DNA结合分析至少进行了6次重复，并提供了代表性数据。
图2
图2
HSF1功能受赖氨酸脱乙酰酶的正向和负向调节。用HSF1和指示的赖氨酸脱乙酰酶表达载体转染人293T细胞。细胞在37°C（-）或42°C（+）下培养2 h，HSF1 DNA结合活性通过EMSA评估(一)RT-qPCR检测内源性HSP70的RNA水平(b条)HSF1免疫沉淀后，通过免疫印迹分析测定HSF1稳态蛋白水平和乙酰化状态(c（c）). EMSA和免疫印迹数据代表了三份实验。RT-PCR数据是6个独立副本的平均值，误差条是S.E.M。。
图3
图3
与KDAC相关的HSF1域各不相同。(一)包含全长蛋白（FL）、氨基末端DNA结合域（DBD）、中央调节域（RD）或羧基末端激活域（AD）的His标记HSF1衍生物在体外转录/翻译时，使用35S trans-label，并与35S标记为HDAC1、HDAC9、SIRT1或HDAC7。用α-His抗体对HSF1蛋白进行免疫沉淀，通过变性凝胶电泳解析沉淀剂，并使用PhosphorImager对放射性标记的蛋白进行可视化。在左上角显示FL HSF1下拉菜单的面板中，各种全长KDAC的位置用星号标记。在IP步骤中，SIRT1通常被蛋白质水解切割，如RD和AD面板所示（蛋白水解片段的组合分子大小等于全长SIRT1）。(b条)体外翻译DBD或DBD-AD融合片段，将其与体外制备的HDAC1、HDAC9、SIRT1或模拟处理的网织红细胞裂解物的等分样品以及放射性标记的HSE寡核苷酸结合，在37°C（-HS）或43°C（+HS）下孵育30分钟，通过天然凝胶电泳分离，蛋白质-DNA复合物用荧光成像仪显示。
图4
图4
在缺乏p23的情况下，HDAC1促进HSF1的DNA结合活性。(一)对体外翻译HSF1的等分样品进行模拟处理或去除p23（p23:IP✓), 在43°C下与放射性标记的HSE孵育30分钟，在有或无HDAC1的情况下添加或不添加p23至正常网织物水平。(b条)对体外翻译的HSF1的等分样品进行模拟处理或去除p23（p23:IP✓), 在存在或不存在野生型HDAC1或脱乙酰酶点突变H141A的情况下，在43°C下用放射性标记的HSE培养30分钟[43]。反应通过天然凝胶电泳进行解析，蛋白质-DNA复合物通过荧光成像仪进行可视化。
图5
图5
KDAC对HSR进行差分调制。测定SIRT1、HDAC1、HDAC 7、HDAC9或HDAC6过度表达对HSF1 DNA结合衰减期的影响。将转染有指定KDAC的293T细胞从37°C转移到42°C以启动实验，在指定时间取出样品，并通过EMSA测定HSF1 DNA结合活性。这些数据代表了一式三份的实验。
图6
图6
HDAC1抑制衰老细胞中的HSR。小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）传代12或26个群体加倍（PD）。EMSA显示PD-12或PD-26细胞对42°热应力的衰减响应(一)通过免疫印迹分析测定HDAC1、SIRT1、HDAC9和HSF1的稳态蛋白水平(b条). EMSA使用PD-12和PD-26组分的直接提取物或等量混合物评估了敲除PD-12中SIRT1或PD-26细胞中HDAC1对HSF1热诱导DNA结合活性的影响。如图所示，通过免疫印迹分析监测HSF1、HDAC1和SIRT1的相对水平。EMSA和免疫印迹数据代表了一式三份的实验。
图7
图7
赖氨酸脱乙酰酶选择性地调节DNA结合蛋白。所示KDAC对激素（100 nM地塞米松）诱导的糖皮质激素受体（GR）DNA结合活性的影响(一)，GR的转录活性(b条)，或细胞分裂周期6（CDC6）蛋白的DNA结合活性(c（c）)已确定。EMSA使用选择GR或CDC6的寡核苷酸和内源性GR靶基因的RNA水平来评估DNA结合活性APA1a公司通过RT-qPCR测量并归一化为GAPDH公司RT-PCR数据是6个独立副本的平均值，误差条是S.E.M。。
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