The Dnmt3L ADD Domain Controls Cytosine Methylation Establishment during Spermatogenesis

doi:10.1016/j.celrep.2015.01.021

.2015年2月17日；10(6):944-956.

doi:10.1016/j.celrep.2015.01.021。 Epub 2015年2月13日。

Dnmt3L ADD结构域控制精子发生过程中胞嘧啶甲基化的建立

乔治·弗拉霍吉安尼斯（Georgios Vlachogiannis）¹, 乍得E尼德胡特², 萨利赫·图纳¹, Athanasia Stathopoulou公司¹, 凯霍·维里¹, 德克·德罗伊^三, 理查德·詹纳¹, 罗伯特·施密茨², Steen K T Ooi公司⁴

附属公司

¹表观遗传信号组，伦敦大学学院癌症研究所癌症生物学系，保罗·奥戈曼大楼，72 Huntley Street，London WC1E 6BT，UK。
²佐治亚大学遗传学系，地址：美国佐治亚州雅典市东格林街120号，邮编：30602。
^三荷兰阿姆斯特丹AZ 1105阿姆斯特丹大学学术医学中心生殖医学中心。
⁴表观遗传信号组，伦敦大学学院癌症研究所癌症生物学系，保罗·奥戈曼大楼，72 Huntley Street，London WC1E 6BT，UK。电子地址：网址：s.ooi@ucl.ac.uk。

PMID： 25683717
预防性维修识别码：项目经理4534369
内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2015.01.021

Dnmt3L ADD结构域控制精子发生过程中胞嘧啶甲基化的建立

乔治·弗拉霍吉安尼斯（Georgios Vlachogiannis）等。单元格代表. 2015.

.2015年2月17日；10(6):944-956.

doi:10.1016/j.celrep.2015.01.021。 Epub 2015年2月13日。

作者

附属公司

¹表观遗传信号组，伦敦大学学院癌症研究所癌症生物学系，保罗·奥戈曼大楼，72 Huntley Street，London WC1E 6BT，UK。
²佐治亚大学遗传学系，地址：美国佐治亚州雅典市东格林街120号，邮编：30602。
^三荷兰阿姆斯特丹AZ 1105阿姆斯特丹大学学术医学中心生殖医学中心。
⁴表观遗传信号组，伦敦大学学院癌症研究所癌症生物学系，保罗·奥戈曼大楼，72 Huntley Street，London WC1E 6BT，UK。电子地址：s.ooi@ucl.ac.uk。

PMID： 25683717
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内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2015.01.021

勘误表in

Dnmt3L ADD结构域控制精子发生过程中胞嘧啶甲基化的建立。
Vlachogiannis G、Niederhuth CE、Tuna S、Stathopoulou A、Viiri K、de Rooij DG、Jenner RG、Schmitz RJ、Ooi SKT。 Vlachogiannis G等人。 Cell Rep.2015年5月12日；11(6):990. doi:10.1016/j.celrep.2015.04.041。Epub 2015年5月12日。细胞报告2015。 PMID：28843284 免费PMC文章。没有可用的摘要。

摘要

哺乳动物配子发生的一个关键方面是基因组DNA甲基化的重编程。无催化活性的适配器Dnmt3L对于确保这种情况正确发生至关重要，但其作用机制尚不清楚。利用基因靶向设计一个单氨基酸突变，我们证明Dnmt3L组蛋白H3结合域（ADD）对精子发生是必要的。突变生殖细胞的全基因组单碱基重溶DNA甲基组分析显示，重复序列和非促性腺激素CpG岛的CG甲基化总体降低。引人注目的是，我们还观察到非CG甲基化的损失更为严重，这表明ADD在这一过程中发挥了意想不到的作用。这些表观遗传缺陷与精原细胞缺陷相结合，突变细胞在基因表达和反转录转座子活化方面表现出显著变化。我们的结果表明，Dnmt3L ADD对于Dnmt3GL功能和完全生殖适合度是必要的。

PubMed免责声明

数字

图1
前精原细胞（A）肽下拉数据中的全基因组亚硫酸氢盐序列分析显示体外转录和翻译的重组小鼠Dnmt3L蛋白与组蛋白H3肽（氨基酸1–21）的N末端之间的相互作用。箭头表示Dnmt3L蛋白质。输入通道中的较高条带代表BSA，在肽结合期间用作阻断剂。蛋白质在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上溶解，然后使用生物安全考马斯染色（Bio-Rad）进行染色。注意，当天冬氨酸在124位（D124A）突变为丙氨酸时，这种相互作用特别丢失。（B）饼图显示了甲基胞嘧啶在野生型原发性肝癌（PSG）CG、CHG和CHH环境中的分布。本次分析和后续分析中只使用了唯一映射的读取。H指除鸟嘌呤以外的任何碱。（C） CHG和CHH背景下甲基化胞嘧啶近端和远端碱基的Weblogo图。（D）比较野生型与野生型甲基化位点相对标准化数量的条形图*Dnmt3L型*^A/A公司巴黎圣日耳曼。（E） Box-whisker图显示了野生型和*Dnmt3L型*^A/A公司PSG基因组DNA分为100-bp的片段。方框表示四分位数，胡须划分最大值和最小值。精确p值<2.12×10⁻¹⁶（F）显示不同序列类别CG甲基化水平的热图。（G）描述父系和母系印迹差异甲基化区域（DMR）甲基化水平的条形图。DMR坐标由Xie等人获得。(2012).

图2
在所有基因中观察到CG和非CG甲基化水平相似，并且减少了*第124天*E16.5 PSG中高表达和弱表达/不表达基因的标准化CG和CH甲基化水平的突变（A）Box-whisker图。还显示了所有RefSeq基因的甲基化水平。E16.5 PSG表达数据来自Seisenberger等人。(2012). 高表达基因与弱表达基因的Wilcoxon秩和检验结果为1.403×10⁻⁵和4.091×10^×4分别用于CG和CH甲基化。（B）显示不同基因组CG和CH基因体甲基化的Metaplot。蓝线和红线分别表示在野生型和突变型中观察到的水平。注意，无论基因活性如何，水平都是相似的。（C）不同细胞类型和组织中所有基因的标准化CG甲基化水平的Metaplot显示。（D） Box-whisker图显示野生型和*Dnmt3型*^A/A公司巴黎圣日耳曼。Wilcoxon秩和文本结果，E16.5高与E16.5低：p=1.403×10⁻⁵（mCG），p=4.091×10⁻⁴（mCH）。（E）显示基因组中每个甲基化胞嘧啶在不同组织和细胞类型中甲基化水平分布的图表。向右移动（接近1.0或100%）表明，与生殖细胞中观察到的较低的个体甲基化水平相比，根据测序数据，更多的甲基胞嘧啶在100%的时间内被甲基化。野生型甲基化胞嘧啶最高水平甲基化的频率高于*Dnmt3L型*^A/A公司测试生殖细胞和其他体细胞组织。数据表明，与分化组织相比，PSG的甲基化程度较高。

图3
Dnmt3L型*D124A型*突变导致生育缺陷（A）15周龄儿童睾丸切除图像*Dnmt3L型*^+/+和*Dnmt3L型*^A/A公司动物。（B）生物特征数据比较*Dnmt3L型*^+/+和*Dnmt3L型*^A/A公司动物。注意Dnmt3L^不适用动物睾丸重量显著减少(*Dnmt3L型*^+/+：n=19，年龄：8-19周；*Dnmt3L型*^不适用：n=18，年龄：8-19周）。*Dnmt3L型*^A/A公司男性产生的精子也明显少于同龄男性*Dnmt3L型*^+/+男性（n=6，年龄：15-17周）。两个*Dnmt3L型*^A/A公司动物被发现无精子症。平均产仔数*Dnmt3L型*^A/A公司雄性配种犬也减少了（5.6只幼犬对9.2只幼兽）。对于*Dnmt3L型*^+/+记录了来自四个不同螺柱的四窝动物。对于*Dnmt3L型*^A/A公司记录了来自八个不同螺柱的八窝动物。散点图显示平均值±SEM。精确的p值为0.0374（标准化睾丸质量，NMT）、0.0087（精子计数）和0.0283（产仔数）。（C）固定睾丸和石蜡包埋睾丸H&E染色切片的低倍（6倍）和高倍（30倍）图像*Dnmt3L型*^A/A公司雄性（16周）。注意正常（I）和空（II）生精小管的重合。SG，精原细胞；P、粗线期精母细胞；rSt，圆形精子细胞；eSt，精子细胞伸长；Ap，凋亡细胞。（D）条形图描述了FACS测量的不同细胞群的绝对细胞数（平均值±SEM）。精确的p值为0.0059（GFP⁺)0.0012（有丝分裂/4n、二倍体/2n和单倍体）。（E）任一细胞减数分裂扩散的免疫荧光显微照片*Dnmt3L型*^+/+或*Dnmt3L型*^A/A公司睾丸。使用Scp1（联会复合体1）抗体对扩散物进行染色。请注意*Dnmt3L型*^A/A公司雄性产生的精母细胞能够进行正确的染色体配对（正常），以及在此过程中出现缺陷（异常）。

图4
基因表达改变*Dnmt3L型*^A/A公司精原细胞（A）中位数标准化基因的热图显示超过2倍的对数₂表达上的差异。秩乘积分析显示，分别有530和411个基因在*Dnmt3L型*^不适用(*A/A公司*)与野生型（+/+）生殖细胞相比。从每个基因型的四只单独的9-dpp动物中纯化SSC。（B） Bonferroni修正的p值，用于在中上调或下调的基因集中富集选定的代表性功能基因类别*Dnmt3L型*^A/A公司SSC。类别1-3、7和8是基因本体生物学过程，4和6是基因本体分子功能，6是解释域。上调基因组中没有Interpo结构域富集。（C） SSC标记的qRT-PCR分析。条形图显示平均值±SEM。精确p值为0.0022（Pouf51、Sox3、Dazl、Rbmy、CD9）、0.0087（Ngn3、Sohlh2）和0.0455（Bcl6b）。

图5
PRC2组分和H3K27Me3在下调基因处富集*Dnmt3L型*^A/A公司显示下调基因的Suz12、Ezh2和H3K27Me3的SSCs（A）顺着基因体（转录起始位点[TSS]的±4 kb）的转基因图更可能是PRC2复合物的靶点。图中显示了小鼠ESCs中所有基因（灰色）和上调基因（红色）和下调基因（绿色）中Ezh2和H3K27Me3（输入）的ChIP-seq序列读取平均数*DnmtL公司*^A/A公司南南合作。序列读取数与基因TSS的基因组距离绘制成每百万总读取数的读取数。（B） PcG靶基因CG、CHG和CHH甲基化的基因-体甲基化图（蓝线）。E16.5 PSG（红线）中低/弱表达基因以及所有RefSeq基因（黑线）的甲基化图显示为对照。数据表明，1-dpp PSG中PcG靶基因的CG或非CG甲基化缺乏特异性富集。

图6
反转录转座子的表达和甲基化分析*Dnmt3L型*^A/A公司测试（A）来自*Dnmt3L型*^+/+和*Dnmt3L型*^A/A公司用所示探针进行原位杂交的动物。导管*Dnmt3L型*^A/A公司睾丸表现出可变的反转录转座子表达（注意，并非所有的小管信号均为阳性）。野生型部分不显示特定的信号。信号检测持续时间相等。图像代表了从四种不同动物的四个切片中观察到的两种基因型的信号。（B）睾丸切片的高倍显微照片*Dnmt3L型*^+/+和*Dnmt3L型*^A/A公司使用所示探针进行原位杂交的动物。对于原位LINE-1，从8周龄和5周龄的动物中采集睾丸(*Dnmt3L型*^+/+和*Dnmt3L型*^A/A公司分别）。对于原位IAP，从16周龄的动物身上采集睾丸；这些图像代表了所分析的四种不同动物的四个截面。（C）含有反转录转座子的中位标准化转录物的热图显示超过2倍的对数₂表达上的差异。绿色表示下调；红色表示上调。只显示了与包含重复元素的转录本杂交的探针。星号表示探针与包含多个反转录转座子的转录物杂交。数据表明逆转录转座子在*Dnmt3L型*^A/A公司精原细胞9dpp。（D）方框图显示最近的近端/上游ERV家族重复序列与中上调和下调基因的接近性*DnmtL公司*^A/A公司SSC。上调基因的TSS与ERV/LTR家族近端/上游逆转录转座子非常接近。使用Wilcoxon秩和检验进行统计分析，比较各组（上调或下调）与所有基因的平均最近距离。精确的p值为0.01279（上调基因）和0.9953（下调基因）。（E）比较ERV与上调基因附近甲基化水平的点图。注意，通常情况下，相同的重复序列在*Dnmt3L型*^A/A公司PSG与野生型相比。（F）（E）中描述的相同数据的热图。数据表明，ERV与上调基因非常接近*Dnmt3L型*^不适用SSC在PSG中被低甲基化。

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