跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2015年2月13日；10（2）：e1004647。
doi:10.1371/journal.ppat.1004647。 eCollection 2015年2月。

牙龈卟啉单胞菌逃避人类髓系树突状细胞的自噬和细胞内杀伤涉及DC-SIGN-TLR2串扰

艾哈迈德·埃尔·阿瓦迪 1, 布罗迪·迈尔斯 2, 伊丽莎白·科西 三, 佐亚·B·库拉戈 4, 奇特拉·D·帕拉尼 4, 罗杰·马奇 1, 詹妮弗·沃勒 5, 卡罗琳·A·根科 6, 康妮·斯洛克姆 7, 马修·曼宁 8, 帕特里夏五世·舍恩莱因 8, 克里斯托弗·卡特勒 1
附属公司

牙龈卟啉单胞菌逃避人类髓系树突状细胞的自噬和细胞内杀伤涉及DC-SIGN-TLR2串扰

艾哈迈德·埃尔·阿瓦迪等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

通过模式识别受体（PRR）在专业抗原提呈细胞（如树突状细胞（DC））上表达的信号对被吞噬微生物的命运至关重要。在树突状细胞表达的众多PRR中，有Toll样受体（TLR）和C型凝集素，如DC-SIGN。DC-SIGN是几种主要人类病原体的免疫侵袭靶点，尽管其在病原体细胞内途径至自噬体中的作用尚不清楚。在此，我们研究了DC-SIGN和TLR在人类单核细胞衍生DC（MoDCs）中牙龈卟啉单胞菌逃避自噬和存活中的作用。我们采用了一组牙龈卟啉杆菌等基因菌毛缺陷菌株，其中Mfa-1菌毛（DC-SIGN配体）和FimA菌毛（TLR2激动剂）存在明确缺陷。我们的结果表明，MoDCs对Mfa1+P.牙龈菌菌株的DC-SIGN依赖性摄取导致了较低的细胞内杀伤和较高的细胞内牙龈杆菌含量。此外，Mfa1+P.牙龈主要包含在单膜囊泡中，在那里细胞内存活。TLR2的激活和/或自噬降低了存活率。牙龈Mfa1+P.菌株未诱导显著水平的Rab5、LC3-II和LAMP1。相反，通过DC-SIGN非依赖性方式摄取牙龈假单胞菌与通过Rab5的早期内吞途径相关，LC3-II和LAMP-1增加，以及双膜细胞内吞噬细胞的形成，这是自噬的特征。这些结果表明，牙龈Mfa-1+P选择性参与DC-SIGN促进了抗菌自噬和溶酶体融合的回避，导致髓系DC细胞内持续存在；然而，TLR2激活可以克服DC中的自噬逃避和病原体持续存在。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。胞内Mfa1含量高+人类MoDC内的Pg。
A）感染病毒的发展中国家的透射电子显微镜（TEM）牙龈卟啉单胞菌持续2、12和24小时（左、中、右面板）。切片显示Cont.（未感染）、Pg381、Mfa1的细胞内和细胞外含量+Pg和FimA+Pg感染了不同时间点的MoDC。B）该图显示了牙龈卟啉单胞菌感染24小时后出现菌株。对感染Pg381或等基因突变株的MoDC进行裂解，将存活的细胞内细菌重新悬浮并在厌氧肉汤中保持5天。该数据表示从三个健康个体采集的MoDC中的CFU。通过不同组的单向方差分析和Tukey检验对3个不同实验中的多组比较的平均值±标准差（一式三份）进行分析（*在第页<0.001).C）Pg381和突变菌株（Mfa1+Pg和Fima+Pg）在无DC的厌氧条件下。采用不同组的单向方差分析和Tukey检验对3个不同实验中的多组比较进行平均值±标准差分析。
图2
图2。Mfa1型+Pg上调人类MoDCs中DC-SIGN的表达。
A）DC-SIGN mRNA表达牙龈卟啉单胞菌-感染了0.1、1和10个MOI的MoDC。图中显示了Pg381和突变株感染12小时后的基因表达。使用内源性控制GAPDH（ΔCt）对目标基因（DC-SIGN）进行标准化，并使用2-（ΔΔCt）方法。使用t检验这说明了在3个不同的实验中感染和未感染对照的聚集(*第页<0.001).B）未感染MoDC（续）（上面板）、感染Pg381（中面板）和Mfa1的MoDC的免疫电镜+Pg突变体（下面板）。在感染Mfa1的细胞膜和细胞质中检测到阳性DC-SIGN的金颗粒（标记为红色环）+Pg菌株。在感染Pg381的MoDC的细胞膜中检测到DC-SIGN的最小阳性染色，而在这些细胞中未检测到细胞质金标记。C）Pg381、Mfa1感染人外周血单个核细胞表面DC-SIGN的流式细胞术分析+Pg和FimA+Pg.强度分析使用克鲁斯卡尔·沃利斯检验分析不同组和邓恩检验进行多重比较3个不同实验(*第页<0.01).
图3
图3。细胞内Mfa1含量较低+用雷帕霉素治疗的MoDC中的Pg。
A）Pg381和突变菌株在与有/没有雷帕霉素处理的人MoDC孵育24小时后计数。将溶解的MoDCs悬浮液保存在厌氧肉汤中5天后，对存活的细菌进行测量。该图表示从三名健康个体采集的MoDC内CFU的平均值±标准偏差(*P（P）<0.001）。读数分析使用不同组的单向AVOVA分析和Tukey检验进行多重比较。B）雷帕霉素治疗1小时后MoDC的表观荧光显微镜图像牙龈卟啉单胞菌感染。在雷帕霉素治疗后11小时（感染后12小时），在MoDC中研究LC3-II（红色荧光染料）和细菌菌株（绿色CFSE）。C）CFSE标记荧光强度的定量牙龈卟啉单胞菌使用NIS-Elements BR软件在受感染的MoDC内发出LC3-II信号。使用单向方差分析比较不同组的强度平均值，并使用Tukey检验进行多重比较(*P（P）<0.001).
图4
图4。诱导自噬损害Mfa1的存活+MoDC内的Pg应变。
A）的存续牙龈卟啉单胞菌6、12、24和48小时后MoDC内的菌株。蓝色线条显示牙龈卟啉单胞菌黑线显示了菌株在MoDC内的存活情况，以及它们在无DC的厌氧条件下的存活情况。雷帕霉素对Mfa1的影响+Pg、Pg381和FimA+图中显示了MoDC内的Pg存活率B、 C和D分别是。使用混合模型的三因素重复测量方差分析来测试应变和雷帕霉素治疗随时间推移对OD读数的影响。菌株的存活曲线以蓝色显示，而雷帕霉素处理的效果以红色显示。在没有添加雷帕霉素的MoDCs的情况下，细菌存活率分别以灰色和黑色绘制。统计分析表明，雷帕霉素处理菌株的超时相互作用表明了每个菌株的平均值模式（Mfa1+Pg、Pg381和FimA+治疗组（雷帕霉素）和未治疗组之间的Pg）随时间推移有显著差异(p值<0.=001).
图5
图5。感染Mfa1的人类MoDC中的低LC3-II信号+第页。
A）感染Pg381、Mfa1的MoDC的表观荧光显微镜图像+第页，FimA+Pg和MFB菌株。在红色荧光（德克萨斯红）染料中检测到LC3-II，并用CFSE（绿色）预先标记细菌菌株。共刻度牙龈卟啉单胞菌和LC3-II显示在右侧面板中。B）使用NIS-Elements BR软件定量受感染MoDC内LC3-II的荧光强度。使用单向方差分析比较不同组的强度平均值，并使用Tukey检验对三个不同实验进行多重比较(*第页<0.001, #第页<0.01).C）通过CFSE荧光强度测定MoDC的细菌摄取(*第页<0.001, #第页<0.01).
图6
图6。阻断DC-SIGN抑制Mfa1+在MoDC中摄取Pg并恢复基础LC3-II信号。
A）LC3-II和牙龈卟啉单胞菌感染12小时后，在MoDC内预先使用GP120（DC-SIGN阻滞剂）治疗。在红色荧光染料中检测到LC3-II，细菌菌株用绿色CFSE预先标记。B）LC3-II和牙龈卟啉单胞菌对菌株信号（一式三份）进行统计分析（*和#第页<0.001).C）12小时后，用siRNA处理DC-SIGN（si-DC-SIGN）的MoDC的流式细胞术。左侧面板显示Cont.（未感染）、Pg381和Mfa1中的DC-SIGN减少+感染Pg的MoDC。D）感染Pg381和Mfa1的MoDC（si-DC-SIGN）的表观荧光显微镜图像+在红色荧光染料中检测到Pg.LC3-II，并用绿色CFSE预先标记细菌菌株。E）该图显示了牙龈卟啉单胞菌缺乏DC-SIGN（si-DC-SIGN）的MoDC菌株。读数分析使用不同组的单向方差分析和Tukey检验进行多重比较(*第页<0.001).
图7
图7。低LC3-II在感染牙龈卟啉单胞菌表达Mfa1。
A）感染Pg381和突变株12小时的MoDC中LC3的Western blot检测。B）LC3-II强度的平均值±标准差代表了三个不同的实验，并使用不同组的Kruskal-Wallis检验分析和Dunn检验进行了多次比较。C）Blot显示了在MoDC中阻断溶酶体与Bafilomycin融合后的自噬通量测试。细胞在4nM下用巴非霉素处理4小时。D）用含有和不含有巴氟霉素的Pg381菌株感染的MoDCs中的LC3-II强度。对三个不同实验的强度进行分析，采用Kruskal-Wallis检验分析不同组和Dunn检验进行多重比较。
图8
图8。TLRs激活可恢复LC3-II表达并抑制Mfa1的生长+人类MoDC内的Pg。
A）TLR4配体孵育后MoDCs上CD83的流式细胞术(大肠杆菌LPS）和TLR1和2配体（Pam3csk4）持续4小时。B）与TLR4和TLR1&2配体孵育后，MoDC内LC3-II（红色）的免疫荧光图像(大肠杆菌LPS和Pam3csk4）C）该图表示24小时后从三名健康个体采集的MoDC内CFU的平均值±标准偏差(**第页<0.001).
图9
图9。双膜泡的形成牙龈卟啉单胞菌-受感染的MoDC。
A）MoDC与Pg381和Mfa1早期相互作用的扫描电子显微镜（SEM）+Pg（上面板10000x，下面板25000x）。B）MoDC与Pg381相互作用的SEM（细菌的绿色斑点由计算机生成）。C）感染Pg381、Mfa1的MoDC内自噬体样结构的透射电镜观察+Pg和FimA+Pg 12小时（分别为上、中、下面板）。右侧和左侧部分显示随机选择部分的不同放大倍数。Pg381和FimA+Pg菌株大多封闭在特征性的双膜细胞内囊泡中（橙色箭头）。相反，Mfa1+Pg逃过这些自噬（双膜）小泡，被包裹在单膜结构内或自由占据细胞质（绿色箭头）。D）将双层膜中的细菌比率与MoDC中的细菌总数进行比较，并绘制成百分比。感染12小时后，计数单膜囊泡或双膜囊泡中的细菌。对每个样品在三个随机选择的网格中对每个菌株进行计数。不同组的Kruskal-Wallis试验和Dunn试验用于多重比较的细菌计数分析(*p<0.01).
图10
图10。受感染的国家/地区的LAMP1下降牙龈卟啉单胞菌表达Mfa1。
A）感染预先标记细菌（绿色CFSE）的MoDC的表观荧光显微镜图像。利用杆状病毒转基因将红色荧光蛋白（RFP）嵌合物转导给MoDCs检测到LAMP1。B）在三个不同的实验中量化了LAMP1的荧光强度平均值±标准偏差(*第页<0.001).C）上面的散点图显示了感染Pg381和突变株的MoDC切片中红色和绿色信号的共同定位。下面的图显示了Pearson在3个不同实验中对每个领域内三个随机选择的感兴趣区域（ROI）的相关性度量的平均值(*第页<0.0001）（表4和表5）。所有荧光强度分析均采用不同组的单向方差分析和Tukey检验进行多重比较。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Levine B、Mizushima N、Virgin HW（2011）《免疫和炎症中的自噬》。《自然》469:323–335。10.1038/性质09782-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Baxt等人（2013）宿主固有免疫途径的细菌破坏。科学340:697-701。10.1126/科学.1235771-内政部-公共医学
    1. Jo EK、Yuk JM、Shin DM、Sasakawa C（2013）自噬在消除细胞内细菌病原体中的作用。前免疫4:97 10.3389/fimmu.2013.00097-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Deretic V（2010）感染中的自噬。当前操作细胞生物学22:252–262。10.1016/j.ceb.2009.12.009-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Janeway CA Jr，Medzhitov R（2002）先天免疫识别。《免疫学年鉴》20:197-216。-公共医学

出版物类型