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.2015年2月12日；6（2）：e1634。
doi:10.1038/cddis.2015.17。

iASPP通过抑制BRMS1 E3泛素连接酶活性稳定p300和CBP而发挥促凋亡作用

D克莱默 1, M Schön先生 2, M Bayerlová 3, 布莱克曼 4, M P Schön先生 2, 莫尼格 5, M Dobbelstein先生 1
附属公司

iASPP通过抑制BRMS1 E3泛素连接酶活性稳定p300和CBP而发挥促凋亡作用

D克莱默等。 细胞死亡病. .

摘要

p53家族及其辅因子是细胞凋亡的有效诱导剂，并对癌症形成屏障。在此，我们研究了p53促凋亡蛋白iASPP的可能抑制成员对p53同源物TAp73及其辅因子p300和CBP活性的影响。我们发现iASPP与顺铂治疗后的组蛋白乙酰转移酶p300及其同源物CBP相互作用并稳定。反之亦然，shRNA导致iASPP缺失导致p300和CBP数量减少，p300和TAp73与靶点启动子的结合受损，促凋亡TAp73靶基因的诱导减少，凋亡受损。从机制上讲，我们观察到p300调节性E3泛素连接酶BRMS1可以挽救顺铂处理的iASPP缺失细胞中p300和CBP的降解。这表明iASPP通过干扰BRMS1介导的泛素化来稳定p300和CBP，从而促进凋亡敏感性。总之，iASPP过度表达部分消除了BRMS1和CBP在DNA损伤中的相互作用。与正常皮肤组织和良性黑色素细胞痣相比，在人类黑色素瘤中观察到iASPP mRNA和蛋白以及CBP蛋白水平降低。与我们的研究结果一致，iASPP过度表达或敲除BRMS1都会增加黑色素瘤细胞系中p300/CBP的水平，从而增强DNA损伤后的凋亡。综上所述，通过下调iASPP表达水平来破坏p300/CBP的稳定性似乎是导致黑色素瘤细胞化疗耐药的分子机制。

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数字

图1
图1
iASPP结合并稳定p300/CBP以应对DNA损伤。(一)iASPP在顺铂治疗中与p300相互作用。使用未经治疗或顺铂治疗的HCT116细胞（20 μ顺铂16次 h） ●●●●。（Ctrl=与IgG抗体的对照反应，IP=免疫沉淀）。(b条)iASPP与顺铂处理的HCT116细胞中的CBP相互作用。用iASPP-V5表达质粒或空载体对照瞬时转染细胞。24 转染后h，用20μM顺铂24次 h、 然后使用V5标签抗体免疫沉淀iASPP并免疫印迹检测CBP。(c（c）)iASPP基因敲除导致顺铂或达卡巴嗪治疗后p300/CBP蛋白水平降低。从顺铂处理的（20 μM顺铂24次 h） 或达卡巴嗪处理（1 mM达卡巴嗪24 h） HCT116细胞，然后进行免疫印迹分析（DTIC=达卡巴嗪）。(d日)顺铂或达卡巴嗪处理的细胞中iASPP的过度表达会升高p300/CBP蛋白水平。iASPP-V5表达质粒或空载体对照在HCT116细胞中瞬时转染。24 转染后h，用顺铂（20 μM） 再要24小时 h后进行免疫印迹分析。(e（电子）)iASPP在顺铂治疗后降低p300和TAp73的蛋白质稳定性。HCT116细胞处理20 带20的hμM顺铂，然后加入100 μ0的g/ml环己酰亚胺（CHX） h、 1个 h、 2个 h、 或4 小时(（f）)蛋白酶体抑制剂治疗可以在iASPP缺失细胞中重建p300/CBP水平。对含有所示shRNA结构的HCT116细胞进行20次处理 带20的h μ顺铂，然后是4 用10进行额外处理hμM MG132或仅DMSO
图2
图2
iASPP增强p300和TAp73与p73靶基因启动子区域的关联。(一)顺铂治疗后，iASPP缺失细胞中染色质结合p300和TAp73的水平降低。HCT116细胞处理8 带20的h μ顺铂前染色质制备和免疫印迹分析。(b条)p300与iASPP缺失细胞中的p300/p73靶位点结合不良。在顺铂处理的HCT116细胞（8 h、 20个 μM顺铂），然后量化特定基因组位点沉淀DNA的百分比。相对结合描述了p300在IgG控制上的折叠富集。对照组敲除结果设置为100%，并计算iASPP敲除细胞中p300结合的相对损失。显示了三个独立实验的平均结合。重要性由学生的t吨-测试和P（P）-值以星号显示(*P（P）-值<0.05**P（P）-值<0.01***P（P）-值<0.001）。补充文件S2中显示了一种生物和所有对照物的详细ChIP分析。(c（c）)iASPP缺失导致TAp73结合其特定靶基因启动子的减少。P73-或IgG-ChIP以及随后的分析按照(b条). (d日)iASPP敲除导致TAp73在顺铂治疗后从染色质结合转移到可溶性部分。用顺铂处理HCT116细胞（16 h、 20个 μ顺铂），然后将细胞裂解物分离为氚可溶（可溶部分）和氚不溶（染色质结合）部分
图3
图3
iASPP是顺铂治疗后高效p73/p300介导的基因表达所必需的。(一)iASPP敲除导致促凋亡靶基因的诱导水平降低。转导合成iASPP shRNA或控制shRNA的HCT116细胞被处理12次 带20的h μM顺铂。实时qPCR分析基因表达。数值标准化为参考基因HPRT1。条形图表示与未经处理的对照敲除细胞相比的相对mRNA水平。这个P（P）-使用学生的t吨-测试和重要性用星号表示，如图2所示。(b条)shRNA敲低p73导致顺铂治疗后促凋亡靶基因的mRNA水平相应降低。分析按照(一). (c（c）)抑制p300活性可降低顺铂治疗后p73靶基因的mRNA水平。用DMSO或40预处理HCT116细胞μ24小时p300抑制剂C646的M h，然后用20 μM顺铂24次 h和随后的cDNA合成和实时qPCR分析。条形图表示DMSO处理细胞的相对mRNA水平。这个P（P）-使用学生的t吨-测试，显著性用星号表示，如图2b所示。重要性由学生的t吨-测试，以及P（P）-值以星号显示(*P（P）-值<0.05**P（P）-值<0.01）
图4
图4
iASPP参与p300介导的细胞凋亡。(一)iASPP敲除导致顺铂处理细胞中PARP裂解水平降低。HCT116细胞处理24小时 小时，40 μM顺铂。收集细胞裂解物并进行免疫印迹分析。(b条)iASPP耗竭导致顺铂治疗后凋亡细胞数量减少。HCT116细胞未经处理或与40 μM顺铂24次 收获前h和乙醇固定。细胞用碘化丙啶染色，用流式细胞仪测定其DNA含量，以评估与凋亡细胞对应的亚G1组分中的细胞百分比。对所有分析样品应用相同的闸门设置。显著性水平的计算如图2b所示。(c（c）)iASPP敲除降低顺铂治疗后Annexin V染色。HCT116细胞未经处理或与40个μM顺铂24次 收获前h，用Annexin V/7-AAD溶液对细胞进行染色。使用流式细胞术测定未染色、Annexin V阳性和AnnexinV/7-AAD阳性细胞的百分比。所有样本均采用相同的闸门设置。平均值和标准误差来自三个生物复制品。P（P）-计算值如图2b所示。(d日)顺铂介导的细胞凋亡部分依赖p300。在含有对照shRNA的HCT116细胞中，使用siRNA瞬时敲除p300或CBP。对于对照，应用扰乱的siRNA。48 转导后h，用40 μM顺铂24次 h.同时，对具有稳定iASPP shRNA表达结构的细胞进行处理和分析。请注意，CBP的耗竭导致p300水平的代偿性增加，这可能解释了为什么CBP敲除并没有显著影响半胱氨酸蛋白酶的裂解程度。重要性由学生的t吨-测试，以及P（P）-值以星号显示(*P（P）-值<0.05**P（P）-值<0.01）
图5
图5
BRMS1介导iASPP去除和顺铂治疗后p300和CBP的失稳。(一)BRMS1基因敲除可以挽救顺铂治疗的iASPP缺失细胞中的p300和CBP水平。在表达对照组或iASPP shRNA的细胞中，用siRNA瞬时敲除BRMS1。将干扰的siRNA并行转染以进行对照。48 敲除后h，细胞要么未经处理，要么用顺铂孵育（24 h、 20个 μM） 然后进行免疫印迹分析。(b条)iASPP过表达消除了顺铂处理细胞中BRMS1和CBP的相互作用。用BRMS1-GFP表达构建物瞬时转染HCT116细胞，单独转染或与iASPP-V5表达质粒联合转染。24 转染后h，用20 μ顺铂16次 h和20 μM MG132，最后4名 h.使用CBP抗体或同种匹配对照抗体（IgG）进行共免疫沉淀。(c（c）)提出了iASPP介导的细胞凋亡机制。iASPP抑制BRMS1依赖的p300/CBP蛋白酶体降解，从而增强促凋亡TAp73靶基因的诱导
图6
图6
恶性黑色素瘤的特征是iASPP和CBP表达下调。(一)与良性痣和正常皮肤组织相比，原发性黑色素瘤中iASPP的表达强烈下调。对45例原发性黑色素瘤、18例黑色素细胞痣和7例正常皮肤组织切片进行了基因表达研究。对已发布的微阵列数据（GSE3189）进行重新分析，以了解编码iASPP的PPP1R13L基因的基因表达。重要性是用双边学生的t吨-测试并用星号表示，类似于图2。(b条)与正常皮肤组织相比，转移性黑色素瘤中iASPP的表达显著下调。最初的研究由Riker发表等。采用40例转移性黑色素瘤、42例原发性皮肤黑色素瘤和4例正常皮肤组织切片。重新分析微阵列数据（GSE7553）中PPP1R13L基因编码的iASPP的相对mRNA水平，如(一). (c（c）)未经治疗和顺铂治疗的黑色素瘤细胞株显示出低水平的iASPP。用免疫印迹法分析了7种不同的黑色素瘤细胞系（A375、Brown、Lox、HMB-2、Mel2a、MeWo和MV3细胞）和两种不同癌种的细胞系HCT116（结肠腺癌细胞）和U2OS（骨肉瘤细胞）在未经治疗或顺铂治疗（24 h、 20个 μ顺铂）。补充图S6A显示了黑色素瘤衍生细胞和原代黑色素细胞之间iASPP蛋白水平的比较。(d日)人类黑色素瘤细胞核iASPP和CBP蛋白水平降低就地对11例良性痣（包括表皮和皮肤突出部分的复合痣）、9例原发性黑色素瘤和5例皮肤黑色素瘤转移瘤的完整切除活检进行免疫组化iASPP和CBP染色。所有样品平行染色，并评估其细胞质中的相对染色强度与原子核。使用半定量评分评估染色强度，评分范围为0（无染色）到3（高染色强度）。评估是由一位不知道样本身份的皮肤病理学家以“盲法”方式进行的。条形图显示了iASPP和CBP的相对核染色强度。使用学生的t吨-测试并用星号表示(*P（P）-值<0.05**P（P）-值<0.01***P（P）-值<0.001）
图7
图7
iASPP和BRMS1调节黑色素瘤中p300/CBP水平和细胞凋亡。(一)iASPP的过度表达部分重建了黑色素瘤细胞中p300/CBP的水平。将iASPP-V5表达质粒或GFP对照载体瞬时转染到Lox和A375细胞中。24 转染后h，用10 μM顺铂24次 h.随后，制备总蛋白裂解物并通过免疫印迹分析。(b条)iASPP的过度表达增强了顺铂介导的黑色素瘤细胞凋亡。将iASPP-V5表达质粒或对照载体pcDNA3瞬时转染到Lox和A375细胞中。24 转染后h，用20 μM顺铂24次 h、 然后采集细胞并用Annexin V/7-AAD溶液染色。如图4c所示，使用流式细胞术测定未染色、Annexin V阳性和Annexin-V/7-AAD阳性细胞的百分比。显著性计算如图6d所示。(c（c）)BRMS1敲除可提高Lox和A375细胞中的p300和CBP蛋白水平。使用siRNA敲除BRMS1。作为对照，并行转染扰乱的siRNA。48 转染后h，用10μ顺铂和免疫印迹染色检测p300和CBP。重要性由学生的t吨-测试，以及P（P）-值以星号显示(*P（P）-值<0.05）
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