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.2015年2月9日；11(1):787.
doi:10.15252/msb.20145808。

PYHIN免疫调节器的功能相互作用组揭示IFIX是病毒DNA的传感器

本杰明A餐厅 1, 托丽 1, 托德·M·格雷科 1, 马尼·克劳 1, 约翰·福斯勒 1, 珍妮弗·王 1, Ileana M Cristea先生 2
附属公司

PYHIN免疫调节器的功能相互作用组揭示IFIX是病毒DNA的传感器

本杰明A餐厅等。 分子系统生物. .

摘要

人类PYHIN蛋白AIM2、IFI16、IFIX和MNDA是免疫反应、转录、凋亡和细胞周期的关键调节器。然而，它们的蛋白质相互作用和潜在机制在很大程度上仍然没有特征。在这里，我们为所有PYHIN蛋白提供了相互作用网络，并定义了一种功能，用于检测以前未经特征化的IFIX蛋白的病毒DNA。通过设计一个基于细胞的诱导系统，并整合显微镜、免疫亲和捕获、定量质谱和生物信息学，我们鉴定了300多种PYHIN相互作用，这些相互作用反映了不同的功能，包括DNA损伤反应、转录调节、细胞内信号传导和抗病毒反应。鉴于IFIX与抗病毒因子（包括核PML小体）的相互作用，我们进一步表征了IFIX并证明了其在限制疱疹病毒复制方面的功能。我们发现IFIX检测细胞核和细胞质中的病毒DNA，通过其HIN结构域以序列非特异性的方式结合外源DNA。此外，IFIX有助于诱导干扰素应答。我们的研究结果突出了综合蛋白质组学在推断蛋白质功能方面的价值，并将IFIX确立为一种抗病毒DNA传感器，对增强免疫反应至关重要。

关键词：DNA传感；IFIX；PYHIN公司；先天免疫；互动。

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数字

图1
图1。PYHIN家族蛋白相互作用网络的细胞系统构建

  1. PYHIN蛋白在与pyrin结构域相邻的N末端（灰色）或与HIN200结构域相邻的C末端（红色）用GFP标记。

  2. B通过荧光共聚焦显微镜观察所有八个PYHIN-GFP构建物在其各自诱导的HEK293细胞系中的定位。点状结构用白色箭头表示。比例尺，5μm。

  3. C使用荧光共聚焦显微镜测定所有PYHIN-GFP HEK293细胞系中显示PYHIN-GFP点状结构的细胞百分比。显示了单元格和视图字段的数量。平均值±SEM(n个变化）***P（P）≤0.001，比较N和C末端标记的结构（学生的未配对结构t吨-测试；双尾）。

  4. 绘制GFP标记PYHIN蛋白的蛋白质相互作用网络的蛋白质组工作流程。通过无标签AP-MS和SAINT评估PYHIN与猎物相互作用的特异性。

  5. E PYHIN-GFP和GFP免疫分离物通过SDS–PAGE和考马斯染色进行解析。指示PYHIN-GFP毒饵（绿色箭头）。

  6. 通过Western blotting评估PYHIN-GFP免疫分离物的F颗粒（P）、流通（FT）和免疫纯化（IP）组分，以确定PYHIN靶点的分离效率。蛋白质带代表每个指定部分的1%负载。

图2
图2。PYHIN家族相互作用的无标记定量分析

  1. 来自N端和C端标记PYHIN分离物的SAINT筛选猎物蛋白的光谱计数通过其各自毒饵的光谱丰度对数进行标准化2-变换和散射点。对至少两个生物复制品的光谱计数进行平均。PYHIN毒饵用绿色标记，而感兴趣的相互作用用红色标记。

  2. B所有355只SAINT过滤的PYHIN–通过无标签AP-MS识别的猎物相互作用的层次聚类，作为其对数的函数2-转换的光谱计数在生物重复中平均。聚类基于Pearson的相关性和N端和C端GFP标记的PYHIN免疫隔离之间的完全联系。彩色簇显示了SAINT过滤后与指示PYHIN蛋白的以下相互作用：绿色：IFI16，MNDA；金牌：IFI16、MNDA、IFIX；红色：MNDA；紫色：IFI16、MNDA、AIM2；浅蓝色：IFI16；深蓝色：IFI16、IFIX；灰色：IFI1X；橙色：AIM2；深绿色：IFIX，AIM2；造币厂：IFIX、MNDA、AIM2。

图3
图3。PYHIN蛋白家族的相互作用网络
使用STRING数据库评估了345个SAINT过滤的PYHIN–猎物蛋白相互作用，这在N端和C端标记的PYXIN分离物之间很常见，并在Cytoscape中可视化。GO术语被指定给单个猎物节点，并根据指定的分子功能进行颜色编码（图例，左下角）。发现与特定猎物相互作用的PYHIN蛋白的数量由猎物节点形状表示（图例，右下角）。已知的复合物被注释，网络边缘表明与PYHIN蛋白质或其他猎物蛋白质的相互作用。无边缘节点排列在最靠近PYHIN蛋白的簇中，并与之相互作用。
图4
图4。分化单核细胞和原代成纤维细胞中内源性IFI16相互作用

  1. 在PMA处理后，通过针对CD11b的蛋白质印迹来监测THP-1单核细胞的分化。检测IFI16的表达。

  2. 通过Western blot检测分化的THP-1单核细胞和HFF的B细胞质（C）和核（N）组分的IFI16。分离效率通过β-微管蛋白或PARP在C或N组分中的富集得到证实。

  3. C荧光共聚焦显微镜对THP-1和HFF内源性IFI16的定位。比例尺，5μm。

  4. THP-1核中IFI16复合物分析的D工作流程。

  5. 通过SDS-PAGE和考马斯染色观察内源性IFI16复合物的E蛋白和THP-1（左）和HFF（右）的IgG对照物。显示IFI16亚型。

  6. F HEK293细胞中155个IFI16 SAINT过滤相互作用与THP-1和HFF细胞中SAINT筛选相互作用的比较。图中显示了HEK293特有的或与THP-1（293×THP-1）、HFF（293 x HFF）或所有三种细胞类型（293 xTHP-1×HFF）之间共享的IFI16相互作用蛋白的数量（左图）。STRING（右）显示了HEK293和至少一种其他细胞类型之间共享的115个IFI16相互作用的核心集。节点形状表示细胞类型重叠（图中的节点键，左侧），而节点颜色表示基于基因本体分类的蛋白质分子功能。

图5
图5。IFIX与PML体和DNA损伤效应器的相互作用反映了抗病毒特性

  1. 通过STRING评估与PML身体功能或DNA损伤反应相关的SAINT过滤IFIX相互作用，并在Cytoscape中可视化。节点颜色对应于日志2-转换了NSAF/PAX值。人工添加了一些未能通过SAINT，但相对于GFP对照免疫隔离物富集≥两倍的相互作用（灰色）。

  2. 通过荧光共聚焦显微镜（白色箭头）评估HEK293细胞中IFIX-GFP与选定相互作用的B共聚焦。比例尺，5μm。

  3. C IFIX-GFP表达的HEK293细胞在MOI=0.1时感染HSV-1。在感染后72小时，收集子代病毒并进行滴度测定。平均值±SEM(n个=3）*P（P）与对照GFP细胞相比≤0.05。

  4. 通过Western blot（左）评估HFF相对于shScrambled（shSCR）-HFF的D PML敲除效率。shPML-HFF在MOI=0.1时感染HSV-1。在感染后48小时收集子代病毒并进行滴度测定（右）。平均值±SEM(n个=3）**P（P）≤0.01，与shSCR-HFF相比。

  5. E类ifix公司通过RT-qPCR评估shIFIX-HFFs中的mRNA水平，以确定敲除效率（左）。mRNA水平归一化为细胞水平β-肌动蛋白水平。基础水平ifix公司shSCR HFF细胞中相对于肌动蛋白的表达为1.8E-5，这对应于~31的原始Ct值。shIFIX-HFFs在MOI=0.1时感染HSV-1。在感染后48小时收集子代病毒并进行滴度测定（右）。平均值±SEM(n个=3）*P（P）≤0.05，与shSCR-HFF相比。

数据信息：In（C–E），Student’s unpartiedt吨-测试；双尾的。
图6
图6。IFIX是一种DNA结合蛋白，用作病毒DNA传感器

  1. 生物素化ISD与重组GST标记的IFIX-PY（aa 1–100）或IFIX-HIN200（aa 200–492）孵育，并与未标记的ISD竞争。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分解DNA-蛋白质复合物，并显示生物素化底物。

  2. B生物素化ISD，pcDNA3.1，或巴姆HI-线性化pcDNA3.1与重组GST-标记的IFIX-HIN200孵育，并与未标记的ISD竞争。DNA-蛋白质复合物如上所述进行分解。

  3. C重组GST标记的IFIX-HIN200与包含所有可能的10mer寡核苷酸序列的dsDNA阵列孵育，并用荧光GST特异性抗体观察DNA-蛋白质结合。为了说明IFIX-HIN200序列偏好，根据低聚物序列含量绘制荧光强度图。

  4. 用Cy3标记的VACV 70mer转染D IFIX-GFP HEK293细胞，并通过荧光共聚焦显微镜（315×缩放因子）成像。白色箭头表示IFIX-GFP和VACV 70mer之间的共同定位。

  5. 用VACV 70mer转染E对照或IFIX-GFP HEK293细胞，6h后收集总RNA。相对归纳法干扰素β通过RT-qPCR定量。mRNA水平标准化为细胞水平gapdh公司水平。IFIX诱导的HEK293细胞中的基础表达水平干扰素β（右栏位于+Tet/-VACV70）和ifix公司（左栏位于-Tet/-VAVC70）相对于gapdh公司分别为2E-6和3E-6。这对应于原始CT型●28和27的值干扰素β和ifix公司分别是。平均值±SEM(n个＝3）。**P（P）与转染的对照细胞和模拟转染的IFIX-GFP表达细胞相比≤0.01（学生的未配对细胞t吨-测试；双尾）。

  6. GFP或GFP-IFIX HEK293细胞感染HSV-1（MOI=5）并在感染后7 h交联。将细胞裂解物进行α-GFP免疫亲和分离，并使用HSV-1特异性基因组序列通过RT-PCR评估病毒DNA结合（上图）。通过Western blotting（底部）评估分离的GFP或GFP-IFIX（绿色箭头）。

  7. 用荧光共聚焦显微镜观察IFIX-GFP在HSV-1感染的HEK293细胞（MOI=1；感染后4 h）中的定位。病毒蛋白ICP27：感染标志物。比例尺，5μm。

图7
图7。IFIX介导的内在和先天免疫功能模型
IFIX是一种以前未被识别的病毒DNA传感器。IFIX通过其HIN200结构域在细胞质中结合病毒DNA。这通过诱导干扰素-β的表达来启动先天免疫。在HSV-1感染期间，IFIX识别并结合细胞核内的病毒DNA。这种IFIX功能可能通过其与亚核PML体的关联而介导。为了抑制PML体介导的内在防御，已知HSV-1 E3泛素连接酶ICP0以PML蛋白酶体依赖性降解为靶点，分散PML体并减轻强加的抑制。
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