Exendin-4 enhances the migration of adipose-derived stem cells to neonatal rat ventricular cardiomyocyte-derived conditioned medium via the phosphoinositide 3-kinase/Akt-stromal cell-derived factor-1α/CXC chemokine receptor 4 pathway

doi:10.3892/mmr.2015.3243

.2015年6月；11(6):4063-72.

doi:10.3892/mmr.2015.3243。 Epub 2015年1月22日。

Exendin-4通过磷脂酰肌醇3-激酶/Akt-stromal细胞衍生因子-1α/CXC趋化因子受体4途径促进脂肪源干细胞向新生大鼠心室肌细胞衍生条件培养基的迁移

郝周¹, 杨俊杰¹, 婷欣², 张涛（Tao Zhang）¹, 胡顺银¹, 周珊珊¹, 陈光辉¹, 陈云黛¹

附属机构

采购管理信息： 25625935
PMCID公司：项目经理4394957
内政部： 10.3892/月.2015.3243

Exendin-4通过磷脂酰肌醇3-激酶/Akt-stromal细胞衍生因子-1α/CXC趋化因子受体4途径促进脂肪源干细胞向新生大鼠心室肌细胞衍生条件培养基的迁移

郝周等。分子医学代表. 2015年6月.

.2015年6月；11(6):4063-72.

doi:10.3892/mmr.2015.3243。 Epub 2015年1月22日。

作者

郝周¹, 杨俊杰¹, 婷欣², 张涛（Tao Zhang）¹, 胡顺银¹, 周珊珊¹, 陈光辉¹, 陈云黛¹

附属机构

¹中国人民解放军总医院心内科，北京100853。
²天津市第一中心医院心内科，天津300192。

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PMCID公司：项目经理4394957
内政部： 10.3892米/2015.3243

摘要

脂肪衍生干细胞（ADSC）被认为是急性心肌梗死（AMI）后组织修复的合适细胞来源；然而，ADSC的移植效率仍然很低。因此，需要确定一种有效的方法来增强移植细胞向靶点的迁移。本研究使用了一种胰高血糖素样肽-1受体激动剂exendin‑4（Ex‑4）来优化ADSC的迁移能力。目的是确定Ex‑4对ADSC迁移至新生大鼠心室肌细胞衍生条件培养基（NRVC‑CM）的作用和机制。体外培养ADSC和心肌细胞。将ADSCs与Ex-4孵育后，使用MTT法测量细胞增殖，并通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质印迹分析和流式细胞术研究CXC趋化因子受体4（CXCR4）的表达水平。此外，通过ELISA、RT‑qPCR和western blot分析，评估经Ex‑4处理的NRVC‑CM中基质细胞衍生因子‑1α（SDF‑1 a）的表达水平。使用Transwell分析法检查ADSC向NRVC‑CM的迁移。通过western blot分析检测两种细胞中磷酸化（p‑）Akt蛋白表达水平的变化。结果表明，Ex‑4促进了ADSC中CXCR4的增殖和表达，增加了心肌细胞中SDF‑1α的分泌，并增加了两种细胞中p‑Akt的表达水平。然而，在用磷脂酰肌醇3‑激酶（PI3K）抑制剂LY‑294002预处理后，细胞中SDF‑1α/CXCR4级联的改变被消除。此外，Transwell迁移分析显示，在使用Ex‑4治疗后，ADSC通过膜向NRVC‑CM进行了显著移位。然而，用SDF‑1α/CXCR4级联拮抗剂AMD3100和PI3K抑制剂LY‑294002预处理细胞后，这些效应显著降低。这些结果表明，Ex-4通过激活ADSCs和NRVC中的PI3K/Akt途径，增强了SDF‑1α/CXCR4级联。此外，PI3K/Akt-SDF-1α/CXCR4通路的增强可能在ADSC对NRVC‑CM的体外迁移反应中起重要作用。

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数字

图1
ADSC和NRVC的特征。（A）分离的ADSC呈现成纤维细胞样形状（放大倍数，×40）。（B）心肌细胞的形态学特征（放大倍数，×40）。（C） ADSC表型特征的流式细胞术分析。脂肪源性干细胞；NRVC，新生大鼠心室肌细胞；M1，BD FACSCalibur根据对照组进行的阳性范围。

图2
生长曲线显示Ex-4对ADSC增殖的影响。对于ADSCs的生长，Ex-4的最佳浓度为10nm。数值表示为平均值±标准偏差*与正常组相比，P<0.01。Ex-4，exendin-4；脂肪源性干细胞；外径，光密度。

图3
Ex-4对ADSC中CXCR4表达水平和NRVC中SDF-1α分泌的影响。（A）用不同浓度的Ex-4（0–20 nm/l）处理24 h后，采用逆转录定量聚合酶链反应分别测定ADSC和NRVC中CXCR4和SDF-1α的mRNA表达水平流式细胞术用于分析Ex-4治疗后第4代ADSC中CXCR4的水平。红色，用不同浓度的Ex-4处理ADSC 24小时，然后用FITC-标记的CXCR4孵育；绿色的ADSC用不同浓度的Ex-4处理24小时，然后用FITC-标记的免疫球蛋白G孵育。进行Western blot分析以检测（C）CXCR4和（D）SDF-1α的蛋白表达水平。流式细胞术分析第4代ADSC中CXCR4阳性细胞的（E）百分比和从NRVC获得的培养基上清液中SDF-1α的（F）浓度。数值表示为平均值±标准偏差*与正常组相比，P<0.05。脂肪源性干细胞；新生大鼠心室心肌细胞；Ex-4，exendin-4；CXCR4、CXC趋化因子受体4；SDF-1α，基质细胞衍生因子-1α；正常对照（0 nm/l Ex-4）。

图4
Ex-4对ADSC向NRVC-CM迁移的影响。Ex-4-CM和Nor-CM是从添加到Transwell板下室的NRVC中获得的。用Ex-4（Ex-ADSC）处理的ADSC、未处理的ADSCs和用AMD3100（5）预处理的Ex-ADSCsμg/ml）放置在上腔室中。在37°C下孵育12 h后，去除非迁移的ADSC，并用0.05%晶体V染色迁移的细胞，然后在荧光显微镜下观察。数据表示为实验样品与指定为100%的正常样品的比率。（A） Ex-4处理增加了ADSC向NRVC-CM的迁移，而AMD3100预处理（放大倍率×100）可逆转此效应。（B）实验组迁移细胞与正常组相比的相对百分比。结果代表了三个单独的实验。数值表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，与正常组相比；^#与Ex-ADSC和Ex-4-CM组相比，P<0.05。脂肪源性干细胞；NRVC，新生大鼠心室肌细胞；CM，条件培养基；Ex-4，exendin-4；AMD公司。AMD3100；正常对照（Nor-CM）。

图5
Western blot分析经Ex-4和/或LY处理的ADSC和NRVC中t-Akt、p-Akt，CXCR4和SDF-1α的蛋白表达水平。β-actin用作内部参考蛋白。（A） ADSC蛋白表达水平的变化；（B） NRVC中蛋白质表达水平的变化。（C和D）ADSC中p-Akt和CXCR4蛋白表达水平的相对变化。（E和F）NRVC中p-Akt和SDF-α蛋白表达水平的相对变化。数值表示为平均值±标准偏差*与对照组相比，P<0.05。脂肪源性干细胞；NRVC，新生大鼠心室肌细胞；Ex-4，exendin-4；CXCR4、CXC趋化因子受体4；SDF-1α，基质细胞衍生因子-1α；t-Akt，总Akt；p-Akt，磷酸化Akt；LY，LY294002；ctrl，对照（未经处理）。

图6
PI3K/Akt途径对ADSCs向NRVC-CM迁移的影响。用或不用LY294002处理NRVC 2小时，然后用Ex-4（20 nm）处理24小时。从NRVC中收集Ex-4-CM和LY+Ex-4-CM，并将其添加到Transwell板的下腔中。对ADSC进行同样的处理，并将Ex-4-ADSC和LY+Ex-4-ADCs添加到上部腔室。未经处理的ADSC和Nor-CM被定义为Nor组。在37°C下培养12小时后，在至少五个随机选择的田地中观察到迁移的细胞。（A） PI3K/Akt通路参与Ex-4介导的ADSC向NRVC-CM的迁移，因为LY294002预处理部分抑制了Ex-4诱导的迁移反应增强（放大倍数×100）。（B）数据表示为实验组中迁移细胞相对于Nor组的比率。结果代表了三个单独的实验。数值表示为平均值±标准偏差。*与对照组相比，P<0.05；^#与Ex-4治疗组相比，P<0.05，包括Ex4-ADSCs、Ex4-CM和Ex4-ADSCs+Ex4-CM。ADSC，脂肪来源的干细胞；NRVC，新生大鼠心室肌细胞；CM，条件培养基；Ex-4，exendin-4；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶；LY，LY294002；正常对照组。

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