p53 at the endoplasmic reticulum regulates apoptosis in a Ca2+-dependent manner

doi:10.1073/pnas.1410723112

.2015年2月10日；112(6):1779-84.

doi:10.1073/pnas.1410723112。 Epub 2015年1月26日。

内质网p53以钙依赖性方式调节细胞凋亡

附属公司

¹意大利费拉拉大学病理学、肿瘤学和实验生物学科形态学、外科和实验医学系，费拉拉44121；
²意大利的里雅斯特国家实验室（LNCIB），34012；
^三波兰华沙02-093，Nencki实验生物研究所生物化学系；
⁴意大利帕多瓦35129，帕多瓦大学物理与天文学系；意大利帕多瓦35129威尼斯分子医学研究所；
⁵意大利帕多瓦35131，帕多瓦大学生物医学系；
⁶Dulbecco Telethon Institute，Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri，米兰20156，意大利；
⁷马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心医学和病理学系癌症遗传学项目，邮编02215；以及意大利的里雅斯特大学科学研究生院，邮编：34128。
⁸意大利的里雅斯特国家实验室（LNCIB），34012；意大利的里雅斯特大学科学研究部，邮编：34128。
⁹意大利费拉拉44121，费拉拉大学病理学、肿瘤学和实验生物学系形态学、外科和实验医学系；pnp@unife.it。

PMID： 25624484
预防性维修识别码：项目经理4330769
内政部： 1073年10月10日/pnas.1410723112

内质网p53以钙依赖性方式调节细胞凋亡

卡洛塔·乔治等。美国国家科学院程序. 2015.

.2015年2月10日；112(6):1779-84.

doi:10.1073/pnas.1410723112。 Epub 2015年1月26日。

附属公司

¹意大利费拉拉大学病理学、肿瘤学和实验生物学科形态学、外科和实验医学系，费拉拉44121；
²意大利的里雅斯特国家实验室（LNCIB），34012；
^三波兰华沙02-093，Nencki实验生物研究所生物化学系；
⁴意大利帕多瓦35129，帕多瓦大学物理与天文学系；意大利帕多瓦35129威尼斯分子医学研究所；
⁵意大利帕多瓦35131，帕多瓦大学生物医学科学系；
⁶Dulbecco Telethon Institute，Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri，米兰20156，意大利；
⁷马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心医学和病理学系癌症遗传学项目，邮编02215；以及意大利的里雅斯特大学科学研究生院，邮编：34128。
⁸意大利的里雅斯特国家实验室（LNCIB），34012；意大利的里雅斯特大学科学研究部，邮编：34128。
⁹意大利费拉拉大学病理学、肿瘤学和实验生物学科形态学、外科和实验医学系，费拉拉44121；pnp@unife.it。

PMID： 25624484
预防性维修识别码：项目经理4330769
内政部： 1073年10月10日/pnas.1410723112

摘要

抑癌基因p53是阻止细胞转化和肿瘤进展的关键蛋白。受多种刺激激活，p53调节细胞周期阻滞和凋亡。随着其对细胞核内细胞死亡程序的转录控制得到了充分的记录，p53在细胞质中发挥着至关重要的作用，尽管人们对其功能仍知之甚少，它直接调节线粒体水平的凋亡反应。内质网（ER）和线粒体之间的钙（Ca（2+））转移是诱导细胞凋亡的关键信号。然而，控制这种对压力刺激的反应的机制在很大程度上仍然未知。我们发现，在细胞质中，WT p53定位于内质网和内质网与线粒体（线粒体相关膜）之间的特殊接触域。我们证明，在应激刺激下，WT p53在这些部位积聚并调节Ca（2+）内稳态。从机制上讲，一旦激活，WT p53直接与内质网处的肌/内质网Ca（2+）-ATPase（SERCA）泵结合，改变其氧化状态，从而导致Ca（2+）负荷增加，随后向线粒体的转移增强过载反过来导致细胞器形态的改变和凋亡的诱导。WT p53或自然发生的p53错义突变体的药理学失活抑制了内质网的SERCA泵活性，导致内质网到线粒体的Ca（2+）信号减少。这些发现定义了p53在调节Ca（2+）信号依赖性凋亡中的关键非核功能。

关键词：细胞凋亡；钙；内质网；线粒体相关膜；第53页。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
p53定位于ER和MAM。(A类–C类)HCT-116中p53的免疫印迹检测*第53页*^+/+分数。(A类)未治疗状态下的p53定位（UNT）。HCT-116内质网和MAM中p53的积累*第53页*^+/+阿霉素（ADRIA）诱导后的细胞（1μM，6 h）(B类)或在H之后₂O（运行）₂处理（500μM，6小时）(C类). (天–F类)p53（红色）和Sec61-GFP（用作ER标记；绿色）在*第53页*^+/+未处理条件下的MEF（UNT）(天)ADRIA后(E类)或H₂O（运行）₂(F类). (插图)图像的放大倍数更高。(*G公司*)p53激活增加了其ER共定位。p53和ER在*第53页*^+/+MEF量化为总ER标记与p53信号重叠的比例（通过Mander系数共定位法）。为了更好地评价p53与ER的共定位，选择了一个细胞质部分，并增加了对比度。棒材，SEM**P（P）*< 0.05.

**图2。**
ER/MAM处p53的激活和积累使细胞更容易死亡。(A类和B类)诱导细胞凋亡的百分比(A类)H（H）₂O（运行）₂（500μM，12小时）英寸*第53页*^+/+或*第53页*^−/−MEF或(B类)神经酰胺（C2；60μM，12 h）、他吡加金（TG；2μM，12h）、衣霉素（TUN；6μM，12-h）、布氏菌素A（BFA；5 mg/mL，12-h第53页^−/−中小微企业。通过流式细胞术分析，数据显示了膜联蛋白-V-FITC和碘化丙啶（PI）染色阴性的整个细胞群中细胞死亡的百分比。(C类)细胞溶质细胞色素的检测*c（c）*释放和上清液HMGB1释放（坏死标记物）*第53页*^+/+或*第53页*^−/−用H处理的MEF₂O（运行）₂（500μM，12小时）与未处理条件相比。肌动蛋白被用作细胞溶质部分的负荷控制。(天)细胞溶胶细胞色素*c（c）*在中释放*第53页*^+/+和*第53页*^−/−用C2（60μM，12 h）、TUN（6μM，12h）或TG（2μM，12-h）处理MEF。(E类)通过基于形态学参数和PI染色的自动成像和细胞评分分析凋亡与坏死的百分比*第53页*^+/+和*第53页*^−/−用H处理的MEF₂O（运行）₂（500μM，12 h）、MEN（15μM，12h）、TUN（6μM，12-h）、TG（2μM，-12h）或C2（60μM，12.h）。(F类)Z-VAD-FMK治疗抑制细胞死亡*第53页*^+/+MEF（高₂O（运行）₂，500μM，6小时）。(*G公司*)H诱导细胞存活的量化₂O（运行）₂（500μM，12 h）通过自动细胞核计数分析。棒材，SEM(*H（H）*)具有代表性的微观领域*第53页*^+/+和*第53页*^−/−未处理条件下的MEFs，用ADRIA预处理（1μM，6小时），然后用h₂O（运行）₂（1 mM，12小时）。(我)免疫印迹法检测细胞凋亡*第53页*^+/+和*第53页*^−/−MEF和*第53页*^+/+在未经处理的条件下用ADRIA（1μM，6 h）和h预处理₂O（运行）₂（500μM，6小时）。

**图3。**
钙的放松管制²⁺p53诱导后的体内平衡是线粒体结构的应激信号，是细胞凋亡的触发因素。(A类–C类)[Ca的测量²⁺]在ER中使用经激动剂刺激（100μM ATP）的重组aequorin(A类)，胞浆(B类)和线粒体(C类). (天)ER钙²⁺H诱导释放₂O（运行）₂使用基于FRET的Ca测量²⁺-灵敏D1ER-YC4.3探针；D1ER-YC4.3的归一化FRET比值被假定为腔内[Ca²⁺]. (插图)记录的前2分钟的放大部分作为基础。(E类)细胞质钙²⁺H引起的反应₂O（运行）₂（2 mM）在装有Ca的MEF中²⁺-敏感荧光染料Fura-2。[Ca的动力学行为²⁺]_c（c）（钙²⁺细胞质内浓度）的响应表示为340nm/380nm处的荧光比率。(F类)[Ca分析²⁺]_米（钙²⁺线粒体基质中的浓度）₂O（运行）₂刺激（2 mM）。代表性等值面绘制*第53页*^+/+(*G公司*和*H（H）*)和*第53页*^−/−(我和J型)在基础状态（UNT）、阿霉素（1μM，6 h）和/或h后表达线粒体GFP的MEF₂O（运行）₂暴露（500μM，3小时）。(*H（H）*和J型)p53激活和氧化应激诱导过程中线粒体断裂的高分辨率成像*第53页*^+/+和*第53页*^−/−MEF公司。

**图4。**
p53控制线粒体钙²⁺内环境稳定，反过来，ER/MAM室的凋亡敏感性。(A类)激动剂依赖性²⁺]_米中的响应*第53页*^+/+药物阻断p53转录臂后的MEF。(B类)p53-ΔNLS和ER-p53嵌合体的示意图。(C类)免疫荧光图像*第53页*^−/−表达p53-ΔNLS或ER-p53结构的MEF细胞用抗p53抗体（绿色）和Hoechst（核标记物）染色。(天)线粒体钙²⁺中的响应*第53页*^−/−ER-p53或p53-ΔNLS靶向嵌合体再引入后的MEF。(E类)来自三个独立实验的代表性微观领域*第53页*^−/−H前后MEF表达p53-ΔNLS和ER-p53₂O（运行）₂治疗（1 mM，12小时）。(F类)H诱导细胞死亡的评价₂O（运行）₂（500μM，12 h）通过自动细胞核计数分析*第53页*^−/−MEF、，*第53页*^−/−表达ER-p53的MEF，以及*第53页*^−/−MEF表达p53-ΔNLS。棒材，SEM(*G公司*)细胞凋亡标志物的免疫印迹分析*第53页*^−/−MEF和*第53页*^−/−在未经治疗的情况下和H后表达p53-ΔNLS和ER-p53的MEF₂O（运行）₂处理（500μM，6小时）。

**图5。**
p53突变体不能调节线粒体Ca²⁺反应，从而导致细胞凋亡。(A类)线粒体钙²⁺HCT-116激动剂刺激后的反应*第53页*^−/−细胞和HCT-116第53页^−/−再次引入p53-ΔNLS和ER-p53嵌合体或自然发生的p53突变体R175H和R273H后的细胞。(B类)线粒体[Ca²⁺]在对照条件下和阿霉素治疗（1μM，6 h）后，在含有p53 273H突变的MDA-MB 468细胞中测量ATP刺激后。(C类和天)HCT-116诱导细胞凋亡的评价*第53页*^−/−用H处理后表达p53-ΔNLS和ER-p53嵌合体的细胞或自然发生的p53突变体R175H和R273H₂O（运行）₂使用(C类)用免疫印迹法检测裂解的PARP和裂解的caspase 3（500μM，6 h）和(天)自动细胞计数分析（500μM，12小时）。棒材，SEM(E类)HCT-116的代表性图像*第53页*^−/−未经治疗和H₂O（运行）₂治疗（1 mM，12小时）。

**图6。**
p53与SERCA相互作用并刺激Ca²⁺ER中的积累，改变SERCA氧化状态。(A类)内源性SERCA与MBP-p53的体外结合。H1299细胞裂解物与细菌表达的MBP-p53蛋白或MBP孵育，作为对照。Ponceau染色显示实验中使用的MBP蛋白数量。(B类)用抗HA抗体免疫沉淀H1299细胞中瞬时表达的全长（FL）和HA标记的p53缺失突变体，并用Western blot（WB）进行分析。IP，免疫沉淀。(C类)用不同的p53结构瞬时转染H1299细胞（FL，全长p53 WT；ΔNLS，p53-ΔNLS；R175H，p53 R175H；R273H，p53-R273H），然后按指示进行免疫沉淀和免疫印迹。WCL，全细胞裂解物。(天和E类)钙的速率分析²⁺从中分离的内质网囊泡中测量的摄取(天)肝脏*第53页*^−/−和*第53页*^+/+小鼠和*第53页*^+/+阿霉素治疗小鼠（1μM，6 h）或(E类)ER隔间*第53页*^−/−和*第53页*^+/+ADRIA（1μM，30 min，3 h，6 h）治疗后不同时间的MEF。(F类)对HCT-116蛋白样品提取物的二甲基偶合半胱氨酸残基具有抗体反应的免疫印迹*第53页*^+/+以及使用单克隆SERCA2抗体进行免疫纯化的ADRIA诱导后的MDA-MB 468细胞。具有活性p53的细胞显示出较低的半胱氨酸亚砜酸修饰的SERCA。(*G公司*)内质网钙分析²⁺HCT-116的摄取*第53页*^+/+ADRIA诱导后的MDA-MB 468细胞。棒材，SEM。

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