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.2015年1月;17(1):16-31.
doi:10.1016/j.geo.2014.10.009。

前列腺癌细胞TWIST1的bHLH磷酸化结构域的结构功能研究

附属公司

前列腺癌细胞TWIST1的bHLH磷酸化结构域的结构功能研究

拉金德拉·P·加朱拉等。 肿瘤形成. 2015年1月.

摘要

TWIST1基因在发育和癌症等病理疾病中具有多种作用。TWIST1是一种二聚体碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子,以TWIST1-TWINST1或TWIST1-E12/47的形式存在。TWIST1的bHLH中Thr-Gln-Ser(TQS)基序的Thr125和Ser127的磷酸化会在发育过程中影响TWISTl伴侣选择和DNA结合。这些TWIST1磷酸化位点对转移的意义尚不清楚。我们建立了稳定的过表达TWIST1野生型、磷酸化突变型和栓系型的等基因前列腺癌细胞系。我们使用模拟癌症转移阶段的分析来评估这些等基因系。体外试验表明,磷酸化Twist1-DQD突变可赋予与促介导行为相关的细胞特性。与体外野生型Twist1相比,低磷酸化模拟Twist1-AQA突变显示出降低的促介导活性,这表明Twist1-TQS基序的磷酸化对促介导功能是必要的。体内分析表明,Twist1-AQA突变导致转移的能力降低,而Twist1-DQD突变的表达具有良好的转移潜能。栓接TWIST1-E12异二聚体现象复制了TWIST1-DQD突变用于许多体外检测,表明TWIST1磷酸化可能导致前列腺癌细胞中的异二聚物。最后,双磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)抑制剂BEZ235强烈减弱了TWIST1诱导的依赖于TQS基序的迁移。TWIST1 TQS磷酸化状态决定了TWIST1-诱导前列腺癌细胞的前介导能力的强度,这可能部分通过TWIST1-dimeric伴侣选择来解释。

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图1
图1
TWIST1 TQS基序的磷酸化是前列腺癌细胞中TWIST1诱导的EMT细胞标志物谱所必需的。(A) TWIST1蛋白质结构示意图和125位苏氨酸(T125)和127位丝氨酸(S127)位点特异性突变体检查了TWIST1-AQA和TWIST1-DQD(此示意图未按比例绘制)。基本域(蓝色)和螺旋I的位置由序列上方的条形表示。序列下方的红色条表示PKA识别位点。Western blot分析用于稳定表达Vector的(B)Myc-CaP和(C)PC3细胞中TWIST1的表达,并以β-actin作为负荷对照,过度表达类似水平的TWISTI或TWISTl磷酸突变体。~25kDa带是TWIST1免疫反应的优势种。较小的频带可能是Twist1的降解产物或翻译后修改版本。TWIST1启动子报告分析表明,TWIST1-DQD突变体是有效的,但TWIST1-AQA突变体在EMT标记基因的转录调控方面存在缺陷。用萤火虫荧光素酶相关(D)E-cadherin基因表达载体瞬时转染Myc-CaP细胞(CDH1型)启动子结构与a雷尼利亚荧光素酶报告载体转染效率标准化。36小时后,对细胞提取物进行荧光素酶和雷尼利亚活性,并表明TWIST1和TWIST1-DQD过度表达抑制了E-cadherin基因启动子的转录,但TWIST1-AQA突变体对此功能有缺陷。(E) 使用SLUG基因进行了类似的报告分析(SNAI2公司)启动子构建并显示,与野生型Twist1或Twist1-DQD过表达相比,Twist1-AQA突变体没有进行私有转录的能力。每个条形代表至少三个独立实验的值,一式三份。条形代表柱平均值;误差条±SEM。成对双尾t吨测试*P(P)< .05, **P(P)<.01,以及***P(P)< .001. Western blot分析(F)Myc-CaP和(G)PC3细胞中E-cadherin和vimentin的上皮和间充质标记物。
图2
图2
TWIST1磷酸化全TQS基序突变对Myc-CaP前列腺癌细胞的迁移有缺陷。(A) 伤口划伤后直接和24小时后过度表达TWIST1和TWAST1磷酸突变体的Myc-CaP细胞的典型相位对比图。(B) 相对伤口闭合度由归一化为初始伤口面积的剩余伤口面积计算[n个ImageJ软件(NIH)进行了≥3次实验,每次实验三个区域],结果表明,过度表达Twist1-AQA的Myc-CaP细胞迁移性低于野生型Twist1和Twist1-DQD细胞。Mann-Whitney试验:*P(P)< .05, **P(P)<.01,以及***P(P)< .001. (C) TWIST1过表达增加了基质上的单个前列腺癌细胞牵引力,这种牵引力被TWIST1 AQA突变减弱。单个细胞的细胞牵引力(n个=20)使用傅里叶变换牵引显微镜进行测量。顶部面板显示Myc-CaP等基因细胞的典型相位对比图像。底部面板显示牵引图;单元格中的颜色表示Pascal中牵引的绝对大小,箭头表示相对大小和方向。(D) TWIST1和TWIST1-DQD突变体的过度表达增加了条形图格式中表示的投影面积的平均值,而TWIST1-AQA磷酸化突变等基因细胞系对此表型有缺陷。(E) TWIST1和TWIST1-DQD突变体过度表达会增加单个活细胞施加的细胞牵引力或净收缩力矩,而TWIST1-AQA突变体完全缺乏此功能。条形代表柱平均值;误差线为±SEM。通过Mann-Whitney检验,这些值是显著的:*P(P)< .05, **P(P)<.01,以及***P(P)< .001.
图3
图3
TWIST1-TQS基序的磷酸化是TWIST1诱导前列腺癌细胞侵袭所必需的。采用等基因(A)Myc-CaP进行Matrigel的跨井侵袭试验(n个=10)和(B)PC3细胞(n个= 6). 允许Myc-CaP细胞侵入24小时,PC3细胞侵入60小时。TWIST1和TWIST1-DQD过表达增加了Myc-CaP和PC3细胞对Matrigel的侵袭,但TWIST1-AQA突变体的侵袭性并不比Vector强(用柱平均值±SEM表示*P(P)< .05, **P(P)<.01,以及***P(P)<.001,成对双尾t吨测试)。
图4
图4
Twist1-AQA突变体在Twist1-诱导的软琼脂致瘤性方面存在缺陷。使用超低附着培养皿贴壁或悬浮培养细胞。通过Annexin V–Alexa Fluor 488和PI染色以及流式细胞术分析对超低附着条件下的凋亡细胞死亡或失巢凋亡数量进行量化。通过将超低附着条件下的总凋亡分数归一化为粘附细胞的凋亡分数来计算凋亡百分比,并绘制为(A)Myc-CaP的条形图±SEM(n个=7)和(B)PC3(n个=6)TWIST1等基因细胞系(*P(P)< .05, **P(P)<.01,以及***P(P)<.001,成对双尾t吨测试);5 × 105细胞包埋在软琼脂中,培养2周。在至少五个随机字段中对含有50个以上细胞的菌落进行评分。显示了(C)Myc-CaP和(D)PC3 TWIST1等基因细胞系在×4倍放大下的典型相位对比图像。通过将菌落数归一化为细胞总数来计算软琼脂中的克隆原性百分比,并用(E)Myc-CaP的条形图±SEM表示(n个=6)和(F)PC3(n个= 6) (*P(P)< .05, **P(P)<.01,以及***P(P)<.0001(通过曼希特尼试验)。
图5
图5
TWIST1诱导前列腺癌转移需要TQS基序的磷酸化体内用Myc-CaP TWIST1等基因细胞系进行实验性肺转移检测;5 × 105将细胞尾静脉注射到8周龄裸鼠体内,4周后处死,观察肺定植和胸外转移。每个细胞系使用四至六只小鼠组成的队列,并至少进行两次实验。(A) Twist1 DQD小鼠肺肿瘤的代表性尸检照片(黑色箭头)和胸壁大病变(白色箭头)。(B) 比较三种等基因细胞系定植肺部肿瘤能力的列联表体内来自A.TWIST1和TWIST1-DQD的过度表达的Myc-CaP细胞能够形成肉眼可见的肺肿瘤体内频率远高于矢量控制单元(P(P)<.01,通过Fisher精确检验进行比较)。Twist1-AQA盒突变型Myc-CaP细胞具有中间表型体内(P(P)与矢量相比=1;P(P)=.0662,与野生型TWIST1相比;P(P)=.0894,与Fisher精确测试的Twist1-DQD相比)。(C) 注射TWIST1等基因细胞的小鼠胸外转移的代表性尸检照片,转移用黑色箭头表示。这些胸外转移是前列腺癌细胞在尾静脉注射后发生完全转移的结果。(D) 一个列联表比较了三种等基因Myc-CaP细胞系从C.TWIST1和TWIST1-DQD过度表达形成胸外转移的能力,从而使Myc-CaP细胞能够以比载体控制细胞和Twist 1-AQA突变过度表达细胞更高的频率形成胸外结瘤(P(P)<.05(对于TWIST1)矢量;P(P)<.05(对于TWIST1)扭转1-AQA;P(P)<.001适用于Twist1-DQD矢量;P(P)<.001适用于Twist1-DQDFisher精确测试扭转1-AQA)。(E) 从注射Myc-CaP+载体细胞(左)或Myc-CaP+Twist1-DQD(右两个面板)的小鼠尾静脉分离的肺或胸外转移瘤的代表性抗Myc IHC图像。肺肿瘤(中部)和胸外转移(右侧)c-Myc染色阳性,证实肿瘤细胞为Myc-CaP细胞。
图6
图6
TWIST1全球基因表达谱受前列腺癌细胞中TQS基序突变的调控。(A) 通过微阵列对稳定表达载体TWIST1(WT)、TWIST1-AQA(AQA)和TWIST1-DQD(DQD)的Myc-CaP细胞的基因表达分析显示,与磷酸化突变细胞和载体控制细胞相比,TWIST1过表达细胞和载体对照细胞之间差异表达的基因组更多。各组之间的基因表达通过经验贝叶斯调节的方差分析进行,如果B类>Benjamini-Hochberg错误发现率(FDR)为0。(B) 对表达载体TWIST1(WT)、TWIST1-AQA(AQA)和TWIST1-DQD(DQD)的Myc-CaP细胞的基因表达进行监督聚类分析的热图可视化显示,TWIST1磷酸化突变体具有衍生野生型TWISTI基因表达谱。每列代表一个Myc-CaP微阵列样本,每行代表一个基因的以中位数为中心的表达值。高表达以绿色表示,中间表达以黑色表示,低表达以红色表示。(C)从Curated Molecular Signatures数据库中选择的高表达基因集(P(P)<.05,单向Fisher精确检验,Benjamini Hochberg FDR)在一组由TWIST1而不是由TWIST1 AQA差异调节的基因中(上表),该基因与过表达TWIST1的前列腺癌细胞之间的表型差异相关如本研究所示,Twist1-AQA(相对过表达用绿色表示,相对抑制用红色表示)。下表表示Twist1-DQD中过度表达的基因集TWIST1转录组。(D) Myc-CaP和PC3前列腺癌细胞中TWIST1和TWIST1-磷酸突变体的表型总结。T、 扭曲1;AQA,Twist1-AQA突变体;DQD,Twist1-DQD突变体;Vec,矢量控制。
图7
图7
栓系T-E过表达细胞现象学Twist1-DQD突变过表达细胞的促介导行为在体外(A)对TWIST1和E12在稳定表达Vector的Myc-CaP细胞中的表达进行Western blot分析,并用β-actin作为负荷对照,过度表达类似水平的TWISTI或系链版本的TWIST。(B) 上皮和间充质标记物也通过E-cadherin和vimentin的Western blot分析进行评估。系带T-E过度表达的Myc-CaP细胞能够诱导EMT。(C) 使用微阵列基因表达谱数据(图6),选择Twist1-DQD表达的基因表达特征,并通过逆转录酶定量PCR在过度表达栓系和磷酸化突变Twist1的等基因Myc-CaP细胞中测量这些基因的表达。显示每个基因的相对表达,绿色表示过度表达,红色表示表达不足。为了评估样本之间的相似程度,使用完整的链接算法进行了层次聚类,结果用树状图表示。这些数据表明,基于基因表达谱分析,Twist1-DQD和T-E最为相似。将系带T-T和T-E过表达细胞与TWIST1磷酸化突变体过表达细胞在软琼脂中的(D)迁移、(E)跨阱侵袭、(F)抗失巢症和(G)锚定非依赖性生长进行直接比较。除抗失巢凋亡外,所有这些分析中,T-E和Twist1-DQD细胞最为相似。
图8
图8
BEZ235抑制PI3K-mTOR激酶可阻止TWIST1诱导的前列腺癌细胞迁移。(A) 用10 nM BEZ235处理24小时,然后进行伤口刮伤,然后在伤口刮伤24小时后,对过度表达TWIST1和TWISTI磷酸化突变体的Myc-CaP细胞进行代表性相位对比图像。(B) 相对伤口闭合度由归一化为初始伤口面积的剩余伤口面积计算[n个ImageJ软件(NIH)进行了≥3次三场实验],结果表明BEZ235处理只抑制过表达TWIST1的Myc-CaP细胞的迁移。(C) BEZ235对细胞迁移的相对抑制作用是通过将未经处理的细胞迁移潜能正常化为10 nM BEZ235-处理的细胞的迁移潜能来确定的。Mann-Whitney试验:**P(P)< .01.

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    1. Siegel R.、Naishadham D.、Jemal A.癌症统计,2013年。CA癌症临床杂志。2013年;63(1):11–30.-公共医学
    1. Pound C.R.、Partin A.W.、Eisenberger M.A.、Chan D.W.、Pearson J.D.、Walsh P.C.前列腺癌根治术后PSA升高后的自然病史。睡衣。1999;281(17):1591–1597.-公共医学
    1. Thiery J.P.、Acloque H.、Huang R.Y.、Nieto M.A.发育和疾病中的上皮-间充质转变。单元格。2009;139(5):871–890.-公共医学
    1. Spicer D.B.、Rhee J.、Cheung W.L.、Lassar A.B.通过bHLH蛋白Twist抑制肌源性bHLH和MEF2转录因子。科学。1996;272(5267):1476–1480.-公共医学
    1. Lee Y.M.、Park T.、Schulz R.A.、Kim Y.果蝇内脏中胚层中NK-4同源盒基因的扭曲介导激活需要两个不同的E-box调控元件簇。生物化学杂志。1997;272(28):17531–17541.-公共医学

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