N-acetyl cysteine mitigates the acute effects of cocaine-induced toxicity in astroglia-like cells

doi:10.1371/journal.pone.0114285

.2015年1月24日；10（1）：e0114285。

doi:10.1371/journal.pone.0114285。 2015年电子收集。

N-乙酰半胱氨酸减轻古柯碱诱导星形胶质细胞毒性的急性效应

拉梅什·B·巴迪萨¹, 桑杰·S·库马尔², 伊丽莎白·马齐奥¹, 拉舍达·D·豪格布鲁克^三, 约翰·R·艾伦⁴, 迈克尔·戴维森⁴, 谢丽尔·菲奇·佩伊⁵, 卡尔·B·古德曼¹

附属公司

¹美国佛罗里达州塔拉哈西，佛罗里达农工大学药学院。
²美国佛罗里达州塔拉哈西佛罗里达州立大学医学院生物医学系。
^三美国佛罗里达州塔拉哈西佛罗里达农工大学生物系。
⁴美国佛罗里达州塔拉哈西佛罗里达州立大学国家高磁场实验室。
⁵美国佛罗里达州塔拉哈西佛罗里达州立大学生物科学系。

采购管理信息： 25617894
预防性维修识别码： PMC4305286型
内政部： 10.1371/新闻稿.0114285

N-乙酰半胱氨酸减轻古柯碱诱导星形胶质细胞毒性的急性效应

拉梅什·B·巴迪萨等。公共科学图书馆一号. 2015.

.2015年1月24日；10（1）：e0114285。

doi:10.1371/journal.pone.0114285。 2015年电子收集。

作者

附属公司

¹美国佛罗里达州塔拉哈西佛罗里达农工大学药学院。
²美国佛罗里达州塔拉哈西佛罗里达州立大学医学院生物医学系。
^三美国佛罗里达州塔拉哈西佛罗里达农工大学生物系。
⁴美国佛罗里达州塔拉哈西佛罗里达州立大学国家高磁场实验室。
⁵美国佛罗里达州塔拉哈西佛罗里达州立大学生物科学系。

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预防性维修识别码： PMC4305286型
内政部： 10.1371/新闻稿.0114285

摘要

可卡因的半衰期很短，只有一个小时左右，但其主要对中枢神经系统（CNS）的影响相当持久。在中枢神经系统内的所有细胞中，星形胶质细胞可能是第一个表现出可卡因毒性的细胞，因为它们在大脑中相对丰富。进入可卡因可能会引发一些早期反应改变，对其生存产生不利影响，而抑制这些改变反过来会提高其生存率。为了确定这些变化以及在体外能够引起这些变化的最低浓度的可卡因，用可卡因处理大鼠C6星形胶质细胞样细胞（2-4 mM，持续1小时），并检测其毛细胞形态、细胞质空泡化、活力、活性氧（ROS）生成、谷胱甘肽（GSH）水平、，细胞膜完整性、F-actin细胞骨架和组蛋白甲基化。我们在此报告，可卡因显著改变了上述所有特征，可能共同代表了星形胶质细胞样细胞急性毒性介导死亡的关键病理学基础。用临床可用的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC，5mM，30分钟）预处理细胞，在随后应用可卡因期间抑制了这些变化，并减轻了可卡因诱导的毒性。尽管反复接触可卡因，但NAC预处理细胞仍然具有高度的活性，NAC后处理也将可卡因处理细胞的活性提高到较小但显著的水平。我们进一步表明，NAC的这种缓解作用是通过细胞中GSH水平的增加来介导的。这些发现，再加上星形胶质细胞维持神经元完整性的事实，表明靶向并减轻星形胶质细胞早期毒性变化的化合物可能在可可碱诱导的中枢神经系统损伤中具有潜在的广泛治疗作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。胶质纤维酸性蛋白标记物的检测*C6级*星形胶质样细胞。**
细胞与兔抗兔GFAP 1°抗体孵育，然后与山羊抗兔Alexa Fluor 488偶联物孵育2 h。用PI对样品进行细胞核复染，并使用40倍物镜的倒置显微镜进行显微照相。

**图2。急性接触可卡因期间培养的星形胶质细胞样细胞的大体形态特征。**
用PBS处理细胞（对照）(A类)和2-4百万可卡因(**B-D公司**)持续1小时。光学图像是用40倍物镜的反相对比IX-70奥林巴斯显微镜拍摄的结晶紫染色细胞。注意细胞质中明显的可卡因诱导的液泡(B-D类). 比例尺：50μm。

**图3。星形胶质细胞中可卡因暴露的急性影响*细胞活力*（A），*ROS生产*（B），*总谷胱甘肽水平*（C）、和*LDH释放*（D） ●●●●。**
用指定浓度的可卡因处理细胞1小时。使用结晶紫染料（0.1%）摄取方案评估细胞活力(n个= 9).ROS生产通过H负荷细胞进行评估₂DCFDA染料（10μM，30分钟），然后在无酚红介质中接触可卡因。在激发和发射滤光片分别设置在485和530 nm的微型平板荧光计上测量二氯二氢荧光素（DCF）(n个= 4). 年消耗*GSH水平*在接触可卡因后在平板阅读器上进行定量(n个= 6). 用于测量*LDH释放*，用可卡因处理无酚红培养基中的细胞，然后将其在等体积的培养基和来自分析试剂盒的底物中孵育（50μl，30分钟），然后在微板读取器上读取(n个= 12). 所有测量值的数据均表示为平均值±S.E.M(n个=化验次数）**P（P）*<0.05; ***P（P）*与对照组相比，<0.001–0.01 w.r.t。

**图4。可卡因对星形胶质细胞核形态和F-actin细胞骨架的影响。**
显示PBS处理细胞的显微照片（对照，A类)；仅可卡因2、3和4 mM，**B-D公司**分别）；仅NAC（5 mM，E类)；用NAC预处理（30分钟），然后接触可卡因1小时（2、3和4 mM，F类-**H（H）**分别）。细胞用PI（5μg/ml）和Alexa Fluor 488 Phalloidin（6.6μM）培养，然后在40倍物镜的倒置荧光显微镜上成像。图像显示通过F-actin阴茎倍体蛋白染色和PI反染色捕获的结构细胞骨架的变化。卵磷脂染色的荧光强度(我)使用image J软件进行量化。数据表示平均强度±S.E.M(n个= 3, ***P（P）*与相应对照组比较<0.01显著性；^## *P（P）*>0.05与相应对照组比较无显著性差异。

**图5。NAC预处理改善了可卡因诱导的形态学改变。**
用PBS处理细胞（对照，1h）(A类)；仅NAC（5 mM，30分钟）(B)；仅可卡因（2 mM，1 h）(C类)；用NAC预处理（5 mM，30 min），然后接触可卡因（4 mM，1 h）(D类). 细胞用结晶紫染色，并在具有40倍物镜的倒置相差1X-70奥林巴斯显微镜下拍照。比例尺：50μm。

**图6。NAC可减轻可卡因引起的毒性。**
NAC预处理的细胞活力测量(n个= 12,A类)或NAC暴露后(n个= 16,B)和总谷胱甘肽水平(n个= 8–12,C类)NAC预处理（5 mM，30 min），然后暴露于指定浓度的可卡因1 h。数据表示平均值±标准误差(n个=化验次数）**P（P）*<0.05, ***P（P）*与相应对照组相比，<0.01–0.001显著性；^## *P（P）*<0.001单独可卡因与可卡因+NAC之间的比较显著性。

**图7。组蛋白甲基化与急性可卡因治疗。**
甲基化H3-K27的标准曲线(A类). 用NAC预处理细胞（5 mM，30 min；n=6），然后暴露于指定浓度的可卡因1 h(B). 数据表示平均值±标准误差(n个=化验次数）**P（P）*<0.05，与相应对照组比较有显著性；^# *P（P）*<0.05，可卡因单独与可卡因+NAC比较的显著性。

**图8。NAC对可卡因毒性的保护示意图。**
可卡因的急性作用(黑色)星形胶质细胞和NAC的保护模式(红色)通过测量(固体)和/或推断(*破碎的*)增加(*向上箭头*)或减少(*向下箭头*)在指示参数的级别。

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1. Covington HE 3rd，Maze I，Sun H，Bomze HM，DeMaio KD，et al.（2011）组蛋白甲基化在可可碱诱导的应激易感性中的作用。神经元71:656–670。2016年10月10日/j.neuron.2011.06.07-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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