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.2015年2月20日；6(5):2903-16.
doi:10.18632/目标3093。

Clusterin通过EIF3I/Akt/MMP13信号促进肝癌转移

王村 1, 广治金 2, 金浩杰 1, 王宁（Ning Wang） 1, 秦洛 1, 张玉荣 1, 高冬梅 三, 开江 三, 滴水谷 1, 邱京深 1, 喜松获 1, 胡芳媛 1, 天香阁 1, 赵方宇 1, 魏楚 1, 《慧群书》 1, 姚明 1, 文明聪 2, 秦文新 1
附属公司

Clusterin通过EIF3I/Akt/MMP13信号促进肝癌转移

王村等。 Oncotarget公司. .

摘要

Clusterin（CLU）是一种应激诱导的伴侣蛋白，为癌细胞提供增殖和生存优势。然而，CLU在肝细胞癌（HCC）转移中的作用及其分子机制尚不清楚。在本研究中，利用HCC组织芯片（n=198）研究CLU表达与临床病理特征之间的相关性。肝细胞癌组织中CLU的过度表达与总生存期较短和肿瘤复发率较高相关。体外和体内实验表明，沉默CLU可减弱HCC细胞的侵袭和转移，而CLU的异位过度表达可导致HCC细胞强制转移。我们还发现，CLU通过与真核翻译起始因子3亚基I（EIF3I）复合激活Akt信号，进而促进基质金属蛋白酶13（MMP13）的表达和肝癌转移。HCC组织中CLU与MMP13、p-Akt或EIF3I呈正相关。我们进一步观察到，在两种转移模型中，使用CLU抑制剂OGX-011敲除CLU，通过抑制EIF3I/Akt/MMP13信号，显著抑制HCC转移。这些结果表明，CLU是肝癌预后的独立预测因子，并通过EIF3I/Akt/MMP13信号促进转移。使用OGX-011抑制CLU可能是抑制肝癌转移的一种有希望的治疗选择。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露

没有披露潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。肝癌患者CLU表达与生存和复发的相关性
（A） 通过免疫化学分析，CLU在HCC TMAs中的典型表达（得分+++：强阳性；得分++：中度阳性；得分+：弱阳性；得分-：阴性）；（B和C）基于CLU表达的198例HCC患者OS和TTR的Kaplan-Meier分析。（D和E）CLU在早期复发或晚期复发的HCC患者中的预后意义。
图2
图2。CLU促进肝癌细胞的侵袭潜能
（A和B）qRT-PCR和western blotting用于验证SMMC7721-shCLU和HCCLM3-shCLU细胞中CLU的敲除。（C） qRT-PCR和western blot实验证实CLU在HepG2-CLU细胞中有效过度表达。（D-F）在HCC细胞中CLU敲除或过度表达后，使用基质凝胶侵袭试验分析侵袭行为（放大倍数×400）。每项实验一式三份。（G-I）显示各组肺组织切片的代表性图像（放大倍率，×200）。还测量了不同组的转移结节数*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图3
图3。MMP13在CLU介导的HCC侵袭中起关键作用
（A） 热图显示了HepG2-CLU细胞中转移相关基因的改变，与使用人类肿瘤转移RT的模拟细胞相比2profiler PCR阵列。（B） 通过qRT-PCR验证了5个基因（MMP10、MMP13、SSTR2、IL1B和ITGB3）在PCR阵列中的差异表达超过2倍。（C） western blotting分析CLU对MMP13表达的影响。（D） Western blotting显示siRNA处理后HepG2-CLU和HCCLM3细胞中的MMP13有效下调。（E和F）用MMP13 siRNA（放大倍数×400）处理后进行迁移和基质凝胶侵袭试验。每项实验一式三份。分析198例患者肿瘤组织中CLU表达与MMP13水平的相关性（Pearson相关，r=0.4815，P（P）< 0.0001). 显示了三个患者样本的CLU和MMP13的代表性图像。（I和J）HCC患者中CLU和MMP13的共表达预示着最差的生存率和最高的复发率*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图4
图4。CLU通过Akt激活上调MMP13表达
（A） 用Hedgehog、Notch、Jak、TGF-β、Erk、JNK、p38激酶、PI3K或Akt抑制剂处理HepG2-CLU和HCCLM3细胞24小时。用western blotting检测MMP13的表达。（B） western blotting分析CLU对Akt磷酸化的影响。（C） 用50μM LY294002处理HepG2-CLU和HCCLM3细胞24 h。用western blotting检测p-Akt、Akt和MMP13的水平。用50μM LY294002处理HepG2-CLU和HCCLM3细胞24小时（放大倍数×400）后，进行（D和E）迁移和基质凝胶侵袭试验。每项实验一式三份。（F） 在HCCLM3-shCLU组和模拟组（放大×400）的肿瘤连续切片上进行CLU、p-Akt和MMP13的免疫组织化学染色。（G和H）分析了肝癌组织中CLU和p-Akt的相关性（Pearson’s correlation，P（P）< 0.0001). 显示了来自三个患者样本的CLU和p-Akt的代表性图像。（I和J）CLU联合p-Akt的预后价值*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图5
图5。CLU通过与EIF3I相互作用促进Akt磷酸化
（A） 文氏图显示，在HepG2-CLU和HCCLM3细胞中，共有14个蛋白通过co-IP和LC-MS/MS同时鉴定为CLU相互作用蛋白。表中列出了重叠蛋白质。（B） 用EIF3I siRNA转染HepG2-CLU和HCCLM3细胞。通过western blotting检测EIF3I、p-Akt和Akt的水平。（C） 通过免疫荧光（原始放大倍数×1000）验证了HepG2-CLU和HCCLM3细胞中CLU（绿色）和EIF3I（红色）的共放大。（D） 通过co-IP证实了与EIF3I形成的CLU复合物。用EIF3I siRNA转染（E和F）HepG2-CLU和HCCLM3细胞，qRT-PCR和western blotting检测CLU和EIF3I的mRNA和蛋白水平。用（G和H）qRT-PCR和western blotting检测HepG2-CLU和HCCLM3-shCLU细胞中CLU和EIF3I的mRNA和蛋白水平。（一） 在HCCLM3-shCLU组和模拟组（放大×400）的肿瘤连续切片上进行CLU和EIF3I免疫组织化学染色。（J和K）肝细胞癌组织中CLU和EIF3I的相关性（Pearson相关性，r=0.3894，P（P）< 0.0001). 显示了三个患者样本的CLU和MMP13的代表性图像。（L和M）结合EIF3I的CLU预测值**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图6
图6。OGX-011显著抑制肝癌侵袭在体外和体内
（A） 用不同浓度的OGX-011处理SMMC7721和HCCLM3细胞48小时。对蛋白质提取物进行CLU和GAPDH分析。（B和C）迁移和基质凝胶侵袭实验结果表明OGX-011对SMMC7721和HCCLM3细胞具有抑制作用。每项实验一式三份。（D和E）通过H&E染色在尾静脉注射模型（SMMC7721）和原位模型（HCCLM3）中检测OGX-011或对照寡核苷酸治疗小鼠的肺转移。H&E染色显示肺转移瘤的特征性图像。在H&E染色的连续切片上量化肺转移结节的数量（放大倍数×200）。（F） 在肿瘤标本的连续切片上进行H&E染色和抗CLU、抗p-Akt、抗MMP13和抗EIF3I免疫组化染色（放大倍数×400）。（G） CLU介导的肝癌侵袭和转移模型已阐明*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
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