A proteomic approach reveals integrin activation state-dependent control of microtubule cortical targeting

doi:10.1038/ncomms7135

.2015年1月22日6:6135。

doi:10.1038/ncomms7135。

蛋白质组学方法揭示了整合素激活状态依赖性对微管皮层靶向性的控制

附属公司

¹英国曼彻斯特M13 9PT曼彻斯特大学生命科学学院威康细胞矩阵研究信托中心。
²英国曼彻斯特M13 9PT曼彻斯特大学生命科学学院生物质谱核心设施。
^三1] 美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学生物医学工程系，邮编02215[2]美国哈佛大学怀斯生物启发工程研究所，邮编02115。

PMID： 25609142
预防性维修识别码：项目经理4317495
内政部： 10.1038/ncomms7135

蛋白质组学方法揭示了整合素激活状态依赖性对微管皮层靶向性的控制

亚当·拜伦等。国家公社. 2015.

.2015年1月22日6:6135。

doi:10.1038/ncomms7135。

附属公司

¹英国曼彻斯特M13 9PT曼彻斯特大学生命科学学院威康细胞矩阵研究信托中心。
²英国曼彻斯特M13 9PT曼彻斯特大学生命科学学院生物质谱核心设施。
^三1] 美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学生物医学工程系，邮编02215[2]美国哈佛大学怀斯生物启发工程研究所，邮编02115。

PMID： 25609142
预防性维修识别码：项目经理4317495
内政部： 10.1038/ncomms7135

摘要

整合素激活受受体构象变构变化的调节，使细胞能够对细胞外微环境的化学、机械和拓扑特征作出反应。然而，关于活化状态如何将整合素近端区域的分子组成转换为功能读数的整体观点尚缺乏。在这里，我们使用构象特异性单克隆抗体，报道了整合素活化状态依赖复合物的分离及其质谱表征。定量比较，整合网络、聚类、通路和图像分析，定义以构象特异性方式富集的多功能蛋白质模块。值得注意的是，活性整合素复合物专为与微管功能相关的蛋白质而富集。微管在微图形表面上的可视化和活细胞成像表明，活性整合素建立了一个环境，可以稳定细胞周围的微管。这些数据为研究整合素激活与粘附信号之间的全球分子联系提供了资源。

PubMed免责声明

数字

**图1。整合素激活状态依赖性粘附复合物的蛋白质组学分析。**
(一)免疫荧光显微镜显示，与在FN和PDL上扩散的细胞相比，HFF细胞在刺激性和抑制性抗β1整合素单克隆抗体上扩散的形态。细胞肌动蛋白（红色）和维酮（绿色）染色。比例尺，10 微米。插入图像对应于白色虚线框中高亮显示的区域。(b条)使用涂有活化状态特异性抗β1整合素单克隆抗体的顺磁性微球从K562细胞中分离整合素活化状态依赖性粘附复合物并进行蛋白质组学分析的工作流程。单克隆抗体涂层珠在活细胞中招募整合素和相关蛋白，然后用交联剂稳定复合物，并在提取过程中在还原条件下裂解交联物。然后通过SDS–PAGE分离蛋白质，并将整个泳道切成30片，对其进行凝胶内胰蛋白酶消化以通过MS进行分析。从重复的生物分离物中获得每个粘附复合物分离物的MS数据。(**c（c）**)在活性和非活性整合素数据集中确定的蛋白质分布如维恩图所示。(d日)定量MS数据的层次聚类分析。皮尔逊相关系数(第页)在树状图节点处显示；阈值为第页≥0.80用于识别不同蛋白质富集的簇（红色，活性整合素；蓝色，非活性整合蛋白；灰色，未富集）。随附的加热条（底部）指示报告的粘性组件的分布。Bin，20个蛋白质。

**图2。分析激活状态相关的粘附网络。**
(一)根据β1整合素（ITGB1）中报道的蛋白质相互作用（hops）数量，排列MS鉴定的粘附成分的相互作用网络。通过在活性（左）、非活性（右）或两者（中）整合素数据集中的检测将蛋白质聚类。NC，未连接。(b条)已识别的粘性网络按功能类别排列。彩色条上的箭头表示每个类别的蛋白质含量中值；灰色条表示MS鉴定的报告粘着类的比例。鞘磷脂调节器定量来自“其他”粘着类通道'和'E3连接酶'粘附类未被表示（0%已确定）。节点（蛋白质）的颜色取决于其在活性（红色）或非活性（蓝色）整合素复合物（log₂转换）。为了清楚起见，显示了基因符号（蛋白质名称见补充表1）。

**图3。粘附复合体景观的功能富集图。**
(一)根据活性（红色）或非活性（蓝色）整合素复合物中的蛋白质富集程度，MS鉴定的蛋白质中过度表达的细胞成分术语被分层聚集。这确定了与一组类似功能术语相关的类似富集蛋白质簇。箭头表示被指定为局部粘附和微管相关术语的蛋白质簇。伴随的加热条（右侧）表示蛋白质富集中值（对数₂转换）和错误发现率修正*P（P）*值（均<0.05；log₁₀尺度）。灰色条（右侧）突出显示了局部粘附和细胞骨架术语。(b条)中功能富集图上细胞成分术语的附加注释一揭示了活性和非活性整合素复合物富集蛋白质的细胞定位范围和特异性。除了强调的细胞粘附术语外，还标记了含有至少八种蛋白质的簇一.MTOC，微管组织中心；snRNP，小核核糖核蛋白。

**图4。微管（MT）的形态和动力学由整合素激活状态决定。**
(一)蛋白质印迹显示，在与活性β1整合素相关的复合物中，talin和三种+TIP，EB1、ACF7和CKAP5的富集（原始印迹见补充图10）。(b条)HFF在FN上扩散，刺激性和抑制性抗β1整合素单克隆抗体被肌动蛋白（红色）和α-微管蛋白（绿色）染色，相应的高倍图像突出了在抑制性单克隆抗体上扩散的细胞中细胞外周MT位置的差异。通过计算5×2范围内的MT数量来计算MT密度细胞外围μm区域。结果为平均值±标准差(n个FN分别为9、10和8个细胞（刺激性和抑制性）。(**c（c）**)HFF在FN上传播，刺激和抑制单克隆抗体1 用10治疗前h μM诺卡唑45 最小值，随后再冲刷45 min检查MT再生。微管蛋白染色；右下角图像中的虚线表示细胞外围。MT密度测量如下b条结果为平均值±标准差(n个FN分别为3、3和4个细胞（刺激性和抑制性）。(d日)HFF在刺激性和抑制性单克隆抗体上传播1 添加20之前的h μM细胞松弛素D或二甲基亚砜（DMSO）载体控制进一步1 h.细胞肌动蛋白（红色）和α-微管蛋白（绿色）染色；右下角图像中的虚线表示细胞外围。MT密度测量如下b条结果为平均值±标准差(n个=刺激和抑制分别为5和5个二甲基亚砜处理细胞和5和7个细胞松弛素D处理细胞）。比例尺，10 微米****P（P）*<0.001, *****P（P）*<0.0001; 用Tukey方差的单向分析*事后（post-hoc）*中的修正b条，与Tukey的双向方差分析*事后（post-hoc）*中的修正**c（c）**和d日（统计源数据见补充表4）。吸入。，抑制；MW，分子量；NS，不显著；刺激。，刺激。

**图5。活性整合素稳定细胞皮层的微管（MT）。**
(一)使用涂有FN、刺激性和抑制性单克隆抗体的工程化微模式评估MT靶向性。微图样上散布的HFF被染色为小病毒蛋白（红色）、α-微管蛋白（绿色）和配体（蓝色）（上部图像面板）。通过测量微管蛋白通道中的荧光强度（上图），对与配体涂层斑块（下图像面板中的黑色圆圈）相对应的细胞外围区域的MT密度进行量化。结果为平均值±标准差(n个=分别为95、125和97个FN贴片（刺激性和抑制性）。同样的区域也被归类为不包含MT、1-2 MT或捆绑在一起的多个MT，以百分比表示n个补丁（下图）。(b条)用交替的刺激性（红色）和抑制性（蓝色）单克隆抗体斑块对微模式上传播的HFF进行α-微管蛋白（绿色）染色。MTs靶向的细胞外周刺激性或抑制性单抗片断表达为n个补丁(n个=864个补丁）。(**c（c）**)刺激性、抑制性HFF扩散，并对两种单克隆抗体的混合物（1000:1，抑制性：刺激性摩尔比）进行肌动蛋白（红色）和α-微管蛋白（绿色）染色。MT密度测量如图4b所示。结果为平均值±标准差(n个FN分别为9、12、11和10个细胞（刺激、抑制和抑制加刺激）。比例尺，10 微米*****P（P）*<0.0001; Kruskal–Dunn的Wallis测试*事后（post-hoc）*中的修正一，双尾未配对t吨Welch修正测试**c（c）**（统计源数据见补充表4）。共校准。，共定位；吸入。，抑制；NS，不显著；静态。，刺激。

**图6。活性整合素创造了一个稳定细胞皮层微管的环境。**
(一)将表达Lifeact–RFP（红色）和GFP–ensconsin（绿色）以分别显示肌动蛋白和微管的U2OS细胞分散在刺激性和抑制性单克隆抗体上，并通过实时共焦显微镜追踪微管动力学。比例尺，10 微米。图像序列（右侧面板）对应于在230的时间段内记录的白色虚线框（左侧面板）中高亮显示的区域 s（每10次采集一张图像 s；见补充电影1和2）。每个序列的最终图像中的白色虚线表示肌动蛋白通道定义的细胞外围。(b条)视野中每个微管寿命期间微管尖端和细胞边缘之间的距离(n个=15个微管用于刺激和抑制）。2内的微管细胞外围的μm以绿色显示。插图显示三个微管的痕迹。(**c（c）**)时间的长度(t吨，s）每个定量微管保持在2 接种刺激性和抑制性单克隆抗体的细胞外周的μm表示为n个微管(n个分别为71和61微管（用于刺激和抑制）。吸入。，抑制；静态。，刺激。

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1. Wolfenson H.，Lavelin I.和Geiger B.整合素粘附结构和功能的动态调节。Dev.Cell 24，447–458（2013）。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Zaidel-Bar R.、Itzkovitz S.、Ma'ayan A.、Iyengar R.和Geiger B.整合素粘附功能图谱。自然细胞生物学。9, 858–867 (2007).-项目管理咨询公司-公共医学
1. Winograd-Katz S.E.、Fässler R.、Geiger B.和Legate K.R.整合素粘附：从基因和蛋白质到人类疾病。自然修订版分子细胞生物学。15, 273–288 (2014).-公共医学
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