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.2015年1月16日;4(2):155-69.
doi:10.1242/bio.201410413。

EB1有丝分裂期特异性相互作用因子的蛋白质组学研究揭示了SXIP介导的蛋白质相互作用在后期发病中的作用

附属公司

EB1有丝分裂相特异性相互作用物的蛋白质组学研究揭示了SXIP介导的蛋白质相互作用在后期发病中的作用

田村直子等。 Biol开放. .

摘要

微管执行不同的有丝分裂事件,这些事件在空间和时间上是分开的;人们对根本的监管了解甚少。通过结合药物治疗、大规模免疫沉淀和质谱,我们首次报道了微管结合蛋白EB1有丝分裂相特异性蛋白相互作用的综合图谱。在有丝分裂期间,EB1与一些但不是全部的伙伴相互作用。我们表明,与后期相比,EB1与Astrin-SKAP复合体的相互作用在前中期增强,后者是染色体分离的关键调节因子。我们发现EB1和EB3,另一个EB家族成员,可以以SXIP基序依赖的方式直接与SKAP相互作用。使用一种不能与EB相互作用的SXIP缺陷突变体,我们在纺锤体微管和动粒上发现了两个不同的SKAP池。我们证明了SKAP的SXIP基序在控制微管生长速率和后期发病中的重要性,而不会严重破坏纺锤体功能。因此,我们提供了有丝分裂期间EB1相互作用物时间变化的第一张综合图,并强调了EB蛋白相互作用在确保正常有丝分裂中的重要性。

关键词:细胞皮层;动粒;微管;有丝分裂;加号端。

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利益冲突声明

竞争利益:作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1。
图1:plus-end蛋白EB1的有丝分裂相特异性相互作用。
(A) 用于识别EB1有丝分裂相特异性相互作用物的协议,详见材料和方法。(B) 四环素释放后,相对于内源性EB1(*),Flag-EB1(**)的荧光免疫印迹(上面板)和强度图(下面板)水平。用α-EB1和α-γ微管蛋白(负载对照)抗体免疫印迹UTA6或UTA6 Flag-EB1裂解物。(C) 四环素释放24小时UTA6 Flag-EB1细胞的免疫荧光图像h,用α-Flag和α-Tubulin(Tub)抗体进行免疫染色,并用DAPI进行DNA共染色。下部面板显示白色方框区域的放大图像。比例:5µm(上面板)和1µm(下面板)。(D) 不同时期从四环素(Tet)释放的UTA6 Flag-EB1细胞百分比图,免疫染色如(C)所示,微管plus-end(plus-end)、微管壁(MT)或无Flag-EB1-信号的细胞计数(无表达)。误差条代表来自三个独立实验的SEM。(E) 从UTA6 Flag-EB1和UTA6 Flag-Nuf2的裂解物中提取的α-Flag免疫沉淀物的荧光免疫印迹,用所示的抗p150(DCTN1)和抗Flag抗体进行探测。加载细胞裂解物(INP)、免疫沉淀后上清液(SUP)、标记肽洗脱免疫沉淀(IP)和珠粒组分(B)。**表示非特定带。(F) 维恩图显示了DMA停止(蓝色圆圈)、释放(粉红色圆圈)或两者(重叠区域)条件下的EB1相互作用体。图中不包括Flag-Nuf2 IP中发现的蛋白质(对应于每批DMA处理),并包括至少两次在Flag-EB1 IP中找到的蛋白质。圆圈每个区域的字体大小反映了重复之间的再现性。诱饵(MAPRE1/EB1)和阿斯汀(SPAG5)-SKAP(KNSTRN)分别以红色和绿色突出显示。
图2。
图2:Astrin-SKAP复合物以有丝分裂相特异的方式与EB1相互作用。
(A) 免疫印迹显示,与后期(DMA释放)UTA6 Flag-EB1细胞相比,前中期(DMA阻滞)裂解物中α-标记免疫沉淀物(IP)的SKAP增加。用两个荧光通道中的α-Flag和α-SKAP抗体进行免疫印迹检测(合并呈现)。加载免疫沉淀后的细胞裂解物(INP)、上清液(SUP)和珠粒组分(B)。(B) 显示来自DMA停滞(前期)和释放(后期)细胞裂解物的α-Flag-EB1免疫沉淀的免疫印迹(如A所示)的SKAP强度比的再现性的图。显示了三个独立重复的比率、平均值(avg.)和SD值(误差条)。(C,D)酵母双杂交研究,如饼图(左图)中红色和蓝色所示,含有猎物和诱饵蛋白表达载体的菌株。通过激活lacZ公司报告基因,在含有X-Gal的平板上形成蓝色菌落。(C)中菌落的照片(右)显示蓝色发展,表明EB1和SKAP(SKAP::EB1)、EB1和磷酸化SKAP突变体(SKAP(RAA)::EB1的相互作用。没有蓝色显影表明EB1和SKAP(NN)突变体(SKAP(NN)::EB1)之间没有相互作用。蓝色发展减少,表明EB1和磷酸化SKAP突变体(SKAP(RAE)::EB1)之间的相互作用较弱。SV40-p53和SV40-层粘连蛋白之间的相互作用分别作为阳性(+ve)和阴性(-ve)对照。在(D)中,菌落的照片(右侧)显示蓝色发展,表明EB3和SKAP(SKAP::EB3)、EB3和磷酸化SKAP突变体(SKAP(RAA)::EB3。(E) 使用ClustalW2进行序列比对,显示哺乳动物SKAP S/T-X-I/L-P结构域的进化保护(人类:Q9Y448;小鼠:Q9D9Z1;马:F6T184;牛:E1BJ69;狗:E2RST7;大象:G3TLE9)。黄色和红色高亮分别标记进化上保守的Aurora-B一致位点和S/T-X-I/L-P基序。(F) SKAP突变体与EB1或EB3.+的相互作用汇总表和−分别表示积极互动和无互动。+++和+分别表示强相互作用和弱相互作用。(G) 酵母菌落的蓝色强度图显示,与EB1和SKAP相比,EB1和SKAP(RAE)突变体之间的相互作用减少。蓝色强度值的百分比是通过与阳性对照(+ve)中菌落的强度进行归一化得到的,并且是批次控制的。误差条指示SD值。
图3。
图3 SKAP的“SXIP基序”是在纺锤体微管而非动粒上定位SKAP所必需的。
(A) 药物治疗方案示意图:HeLa FRT/TO细胞系用四环素治疗24小时h,然后暴露于MG132中90固定前分钟。(B) 作为(A)处理的HeLa FRT/TO细胞系的代表性免疫荧光图像,表达GFP-SKAP(WT)或GFP-SKAP(NN)突变。用α-GFP和α-Tubulin(Tub)抗体和CREST抗血清对细胞进行免疫染色。比例尺:5微米。下部面板显示放大的图像。(C) 图中显示了表达GFP-SKAP(WT)或GFP-SKAP(NN)突变体的有丝分裂HeLa FRT/TO细胞的百分比,这些突变体在动粒(KTs)、纺锤体微管(纺锤体MTs)或纺锤体极点显示SKAP定位。评分基于SKAP在特定亚细胞部位的富集或缺乏SKAP的富集。n表示单元数。细胞按(A)处理。误差条表示三个独立重复的SEM值。(D) 概率密度分布图,用于比较EB3彗星瞬时速度平均值在单独表达EB3-mKate(对照组)或与GFP-SKAP(WT)或GFP-SKAC(NN)突变体一起表达EB3-m Kate的细胞中的分布。使用plus-tip跟踪器软件获得值,图中排除了峰值平均值大于2×SD的异常值。曲线表示所示条形图值的平滑值。在这三种情况下,每种情况下都至少分析了四个细胞和3300颗彗星。对照组和SKAP(WT)之间的非重叠峰值,以及SKAP(WM)和SKAP之间的非重复峰值表示具有统计显著性差异(*),如使用Wilcoxon秩和检验的p<0.01所证实的。SKAP(NN)和对照组之间重叠的峰值表示无统计学意义的差异(#),使用Wilcoxon秩和检验,p>0.01证实了这一点。
图4。
图4 SKAP过表达以“SXIP-motif”依赖方式延迟后期发病。
(A) 药物治疗方案示意图:用四环素处理HeLa FRT/TO细胞,并用蚜虫灵同步处理16个h,然后从蚜虫精中释放7拍摄前h。(B) 表达GFP-SKAP(WT)或GFP-SKAP(NN)突变的HeLa FRT/TO细胞的时间推移图像。DIC图像(顶部面板)显示细胞的四舍五入、中期板和后期(白色箭头)。荧光图像(底部面板)显示GFP信号。细胞按(A)处理。比例尺:10微米。(C) 表达GFP-SKAP(WT)或GFP-SKAP(NN)突变的HeLa FRT/TO细胞百分比图,该突变在60内启动后期NEBD的min(核膜破裂)。NEBD通过核内GFP-SKAP信号排除损失进行评估,后期发病通过后期细胞伸长进行评估。误差条表示SEM值*统计显著性。采用比例检验计算p值。n表示分析的细胞数量。(D) 表达GFP-SKAP(WT)或GFP-SKAP(NN)突变体的HeLa FRT/TO亲代细胞和HeLa FRT/TO细胞系的后期累积频率图。2内启动和退出有丝分裂的细胞包括h。平均值来自GFP-SKAP表达细胞的3个独立实验重复和HeLa FRT/TO亲代细胞的2个独立实验反复。误差条表示SEM值。(E) 表达GFP-SKAP(WT)或GFP-SKAP(NN)突变体的有丝分裂细胞在MPS1抑制剂存在(+)或不存在(-)的情况下启动后期的百分比图(400nM NMS-P715)延时成像。在延时成像之前添加了抑制剂。误差条显示SD值,p值通过比例测试获得*统计上的显著差异。
图5。
图5:EB1和EB3的共完成比染色体聚集更严重地延迟后期发病。
(A) HeLa中siRNA和蚜虫灵处理示意图H2B-GFP m樱桃-管蛋白细胞。细胞在72h和48成像前h。为了同步化,用蚜虫灵处理细胞24小时h、 然后释放到无药培养基中8次成像前h。成像结束时,收集细胞裂解物进行免疫印迹,以评估蛋白质耗竭程度。(B) 赫拉延时电影中的代表性图像H2B-GFP;mCherry-Tubulin公司用EB1和EB3或对照siRNA寡核苷酸处理的细胞,如(A)所示。比例尺:10微米。(C) 代表性免疫印迹显示从延时成像研究收集的裂解物中EB1和EB3的共同耗竭,如(B)所示。HeLa裂解液H2B-GFP;mCherry-Tubulin公司用指示的siRNA处理细胞,用α-γTubulin、α-EB1和α-EB3抗体进行免疫印迹。(D-E)显示HeLa NEBD染色体聚集时间(D)和后期发病时间(E)的累积频率分布图H2B-GFP;mCherry-Tubulin公司单独用对照或EB1和EB3 siRNA寡核苷酸处理的细胞。图表显示了两个独立实验的平均值,误差条显示了SEM值。n表示单元数。(F) 卡通展示了在存在过量SKAP(i)而不是SKAP(NN)突变体(ii)的情况下,EB与其伙伴失去结合。SKAP-EB相互作用过量会导致有丝分裂阻滞,该模型强调了调控的脉冲-增强复合物相互作用对控制后期发病时间的重要性。

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引用人

工具书类

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