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.2015年1月30日；6(3):1834-49.
doi:10.18632/目标2795。

芥酸诱导的线粒体分裂和凋亡需要线粒体易位以及cofilin和Drp1的相互作用

李国兵 1, 荆州 1, 阿米特·布德拉贾 2, 胡晓野 1, 陈一彪 1, 齐成 1, 刘雷（Lei Liu） 1, Ting Zhou（周婷） 1, 李萍 3, 刘亦虎 3, 宁高 1
附属公司

芥酸诱导的线粒体分裂和凋亡需要线粒体易位以及cofilin和Drp1的相互作用

李国兵等。 Oncotarget公司. .

摘要

Cofilin是肌动蛋白解聚因子（ADF）家族蛋白的一员，在线粒体凋亡的调控中起重要作用。目前尚不清楚cofilin如何调节线粒体凋亡。在这里，我们首次报道在食用十字花科蔬菜中发现的天然化合物4-甲基硫丁基异硫氰酸盐（芥酸）通过cofilin的线粒体易位诱导人类乳腺癌细胞的线粒体分裂和凋亡。重要的是，cofilin通过与dynamin-related protein（Drp1）相互作用调节芥酸诱导的线粒体分裂。cofilin或Drp1的敲除显著降低了芥酸介导的线粒体易位以及cofilin和Drp1的相互作用、线粒体分裂和细胞凋亡。只有去磷酸化的cofilin（Ser 3）和Drp1（Ser 637）易位到线粒体。cofilin S3E和Drp1 S637D突变体模仿磷酸化形式，抑制线粒体易位、分裂和凋亡。此外，cofilin和Drp1的去磷酸化和线粒体移位都依赖于ROCK1的激活。体内研究结果证实，在乳腺癌细胞异种移植小鼠模型中，芥酸介导的肿瘤生长抑制与cofilin和Drp1的线粒体易位、裂变和凋亡有关。我们的研究揭示了cofilin在调节线粒体分裂中的新作用，并表明芥酸是治疗乳腺癌的潜在药物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。迷幻剂诱导人乳腺癌细胞凋亡和线粒体分裂
（A、B）如图所示，用不同浓度的芥酸处理MDA-MB-231（A）和MCF-7（B）细胞9小时或20μM芥酸处理不同时间间隔。细胞凋亡与线粒体膜电位丧失(△Ψm）用流式细胞仪测定。（C、D）制备MDA-MB-231（C）和MCF-7（D）细胞的全细胞裂解物、线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）组分，并使用抗PARP、裂解caspase 3（C-caspase 3）、裂解casase 9（C-caspase 9）、细胞色素C（Cyto-C）、GADPH和Cox IV的抗体进行免疫印迹。（E、F）用20μM芥酸处理MDA-MB-231（E）和MCF-7（F）细胞6 h，用Mitotracker Red CMXRos和细胞色素c（Alexa Fluor 488，绿色）双重染色。通过共焦显微镜采集荧光图像。比例尺代表10μm。线粒体长度的定量按照方法中的描述进行。（G、H）用电子显微镜观察MDA-MB-231（G）和MCF-7（H）线粒体形态。比例尺表示1μm。
图2
图2。迷幻剂诱导cofilin和Drp1的线粒体易位
（A）用20μM芥酸处理MDA-MB-231细胞，制备全细胞裂解物（WCL）、线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）组分，并进行Western blot分析。（B、C）用20μM芥酸处理细胞6 h，用Mitotracker Red CMXRos和Drp1（Alexa Fluor 647，绿色）或cofilin（Alexa-Fluor 488，绿色）染色。通过共聚焦显微镜收集荧光图像。比例尺代表10μm。
图3
图3。迷幻剂诱导线粒体外膜上cofilin和Drp1的相互作用和共定位
（A）用20μM芥酸处理MDA-MB-231细胞6 h，纯化线粒体，用10 ng/ml蛋白酶K在冰上孵育10分钟，然后在17000g下离心15分钟。洗涤后，在2%SDS缓冲液中溶解微丸，并通过免疫印迹法进行测定。（B）制备线粒体部分，并使用抗纤毛抗体进行免疫沉淀，并使用免疫印迹法测定相关的Drp1。IgG代表cofilin抗体的重链（约57kDa）或轻链（约25kDa。星号代表非特异性带。（C）用20μM芥酸处理细胞6 h，用cofilin（Alexa Fluor 488，绿色）和Drp1（Alexa-Fluor 647，红色）染色，并通过共焦显微镜进行评估。比例尺代表10μm。
图4
图4。Cofilin击倒降低芥酸诱导的线粒体分裂和凋亡
用含有慢病毒的构建体感染MDA-MB-231细胞，所述构建体编码扰乱的对照shRNA（shCon）或人cofilin特异性shRNA（shCof）。不使用或使用20μM芥酸处理稳定细胞株6小时。（A）制备全细胞裂解物（WCL）、线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）组分并进行免疫印迹。（B）制备线粒体部分并进行免疫沉淀，以确定cofilin和Drp1的相互作用。星号代表非特定带。（C）用cofilin（Alexa Fluor 488，绿色）和Drp1（Alexa-Fluor 647，红色）对细胞进行免疫染色。（D、E）细胞用Mitotracker Red CMXRos染色并用共焦显微镜观察。比例尺代表10μm。按照方法中的描述测量线粒体长度。（F、G）流式细胞仪检测细胞凋亡。（H）用免疫印迹法测定全细胞裂解物中的C-Caspase 3和细胞溶质组分（C）中的细胞C。
图5
图5。Drp1基因敲除降低芥酸介导的线粒体分裂和凋亡
MDA-MB-231细胞被慢病毒感染，慢病毒含有编码干扰控制shRNA（shCon）或人类Drp1-specific shRNA（sh Drp1）的结构。不使用或使用20μM芥酸处理稳定细胞株6小时。（A）通过免疫印迹法测定全细胞裂解物（WCL）、线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）组分。（B）制备线粒体部分并进行免疫沉淀，以确定cofilin和Drp1的相互作用。（C–E）用cofilin（Alexa Fluor 488，绿色）和Drp1（Alexa-Fluor 647，红色）或Mitotracker red CMXRos对细胞进行免疫染色。通过共焦显微镜采集荧光图像。比例尺表示10μm。线粒体长度的定量按照方法中的描述进行。（F、G）流式细胞仪检测细胞凋亡。（H）用免疫印迹法测定全细胞裂解物中的C-Caspase 3和细胞溶质组分（C）中的细胞C。
图6
图6。芥酸诱导的线粒体分裂和凋亡需要cofilin（Ser 3）和Drp1（Ser 637）的去磷酸化
（A）用20μM芥酸处理MDA-MB-231细胞，免疫印迹法检测细胞裂解产物。（B）用对照空载体或人cofilin去磷酸化（活性，S3A）突变质粒或假磷酸化（非活性，S3E）突变质粒转染MDA-MB-231细胞48 h。用20μM芥子酸处理6 h后，通过免疫印迹法测定线粒体部分。（C，D）用Mitotracker Red CMXRos和cofilin（Alexa Fluor 488，绿色）对细胞进行双重染色。通过共焦显微镜采集荧光图像。比例尺代表10μm。如前所述测量线粒体长度。（E）流式细胞仪检测细胞凋亡。（F）用免疫印迹法测定全细胞裂解物中的C-Caspase 3和细胞溶质组分（C）中的细胞C。（G）用对照空载体或人Drp1去磷酸化（活性，S637A）突变质粒或假磷酸化（非活性，S637D）突变质粒转染MDA-MB-231细胞48小时。用20μM芥酸处理6小时后，通过免疫印迹测定线粒体组分。（H，I）用MitoTracker Red CMXRos和Drp1（Alexa Fluor 647，绿色）标记的转染细胞的共焦显微镜图像。比例尺代表10μm。如前所述测量线粒体长度。（J）流式细胞仪检测细胞凋亡。（K）用免疫印迹法测定全细胞裂解物中的C-Caspase 3和细胞溶质组分（C）中的细胞C。
图7
图7。抑制ROCK1激活或敲低ROCK1减弱芥酸诱导的cofilin和Drp1依赖性线粒体分裂和凋亡
（A）用20μM芥酸处理MDA-MB-231细胞，免疫印迹法检测细胞裂解产物。（B、C）用20μM Y-27632预处理MDA-MB-231细胞2 h，然后用20μM芥酸处理6 h。用免疫印迹法测定全细胞裂解物（WCL）、线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）组分。CF代表解理碎片。（D、E）细胞用Mitotracker Red CMXRos染色并用共焦显微镜观察。比例尺代表10μm。如前所述测量线粒体长度。（F）流式细胞仪检测细胞凋亡。（G）通过免疫印迹法测定全细胞裂解物和细胞溶质组分。（H，I）MDA-MB-231细胞被慢病毒感染，慢病毒含有编码干扰控制shRNA（shCon）或人类ROCK1特异性shRNA（shROCK1）的结构。不使用或使用20μM芥酸处理稳定细胞系6 h。通过免疫印迹法检测全细胞裂解物（WCL）、线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）组分。（J，K）细胞用Mitotracker Red CMXRos染色并用共焦显微镜观察。如前所述测量线粒体长度。比例尺代表10μm。（左）流式细胞仪检测细胞凋亡。（百万）通过免疫印迹法测定全细胞裂解物和细胞溶质组分。
图8
图8。迷幻剂抑制MDA-MB-231异种移植瘤模型的肿瘤生长
（A）芥子苷治疗组和载体治疗组动物存活率的比较。第页-数值采用卡普兰-迈耶法计算。（B）载体对照小鼠和用芥酸治疗的小鼠的平均肿瘤体积。第页<0.01或第页与车辆控制相比<0.0001。（C）芥酸治疗50天期间小鼠体重的变化。（D、E）从代表性肿瘤组织中分离原代细胞，并在DMEM培养基中培养，并用Mitotracker Red CMXRos染色。通过共焦显微镜采集荧光图像。如前所述测量线粒体长度。比例尺代表20μm。（F）流式细胞仪检测原代细胞凋亡。（G）制备了两个载体治疗小鼠和两个芥酸治疗小鼠代表性肿瘤组织的全细胞裂解物（WCL）、线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）组分，并进行了Western blot分析。
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